применение диоксидина в качестве противоопухолевого средства

Формула изобретения

1. Применение диоксидина - 2,3 ди(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксид в качестве противоопухолевого средства.

2. Применение по п.1 в сочетании с гипертермией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в лечении злокачественных заболеваний различных органов, в частности опухолей желудочно-кишечного тракта.

Наиболее значимой проблемой в современной медицине является лечение злокачественных заболеваний различных органов и систем, частота появлений которых на протяжении ряда лет, к сожалению, лишь возрастает.

Большинство опухолей лечится хирургическим путем, что приносит гарантированный успех в лечении незапущенных стадий опухолевого процесса. Современные достижения радиотерапии и химиотерапии как самостоятельных методов лечения приводят к излечению лишь ограниченного числа нозологических форм злокачественных заболеваний, преимущественно на ранних стадиях. В большинстве наблюдений эти методы носят лишь вспомогательный характер и направлены на улучшение результатов хирургического лечения опухолей различных локализаций, а при инкурабельных распространенных опухолевых процессах, когда хирургическое лечение невозможно, целью использования радио- и химиотерапии является лишь пролонгация жизни.

Успехи химиотерапии в последние годы значительны в связи с открытием молекулярных и иммуногистохимических маркеров, позволяющих определить чувствительность химиопрепаратов к тому или иному виду опухоли. Идентификация маркеров, отвечающих за процессы ангиогенеза в растущей опухоли, предопределила понятие так называемой «таргетной» терапии злокачественных заболеваний, используемой параллельно с цитостатиками. Тем не менее, существенного улучшения результатов лечения злокачественных заболеваний при использовании химиотерапии добиться не удалось, что связано в первую очередь с недостаточной противоопухолевой активностью современных цитостатиков и высокой токсичностью, обусловленной воздействием на здоровые ткани. Немаловажную роль играет и дороговизна современных химиопрепаратов, что резко ограничивает их применение в широкой практике. В этой связи актуальным является поиск препаратов, обладающих высокой противовопухолевой активностью с толерантностью к здоровым тканям при невысокой себестоимости.

Выявлена противовопухолевая активность известного препарата «диоксидин», использующегося в качестве антибактериального средства в целях профилактики и лечения гнойно-воспалительных осложнений и заболеваний различных органов.

Диоксидин - 2,3 Ди(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксид - представляет собой зеленовато-желтый кристаллический порошок без запаха, малорастворимый в воде и спирте. Является антибактериальным препаратом широкого спектра действия. Эффективен при инфекциях, вызванных вульгарным протеем, синегнойной палочкой, палочкой дизентерии и палочкой клебсиеллы (Фридлендера), сальмонеллами, стафилококками, стрептококками, патогенными анаэробами (в том числе возбудителями газовой гангрены). Действует на штаммы бактерий, устойчивые к другим химиотерапевтическим препаратам, включая антибиотики (М.Д.Машковский, Москва, 2001, том 2, с.298).

Противовопухолевая активность диоксидина установлена на основании следующих исследований:

Государственным научным центром колопроктологии Росздрава совместно с кафедрой химического факультета МГУ им. Ломоносова, Онкологическим научным центром РАМН и Государственным научно-исследовательским институтом органической химии и технологии проведены экспериментальные исследования с использованием методологии определения степени воздействия диоксидина и цисплатина на опухолевые и нормальные клетки в растворах.

Изучение влияния препаратов диоксидина и цисплатина на физиологическую активность и жизнеспособность клеток аденокарциномы человека линии Colo МТ

В опыте использовалась 5-суточная культура клеток аденокарциномы человека Colo МТ, которая инкубировалась с диоксидином и цисплатином при температуре, близкой к температуре тела человека 37°С, в течение 2-часового интервала времени.

Для оценки полученных результатов был подсчитан показатель доли погибших клеток, выраженный в процентах. Доля для клеточных проб с диоксидином и цисплатином расчитывалась относительно пробы культуры с физиологическим раствором, инкубируемой в тех же условиях.

В Таблице 1 приведены результаты подсчета клеток, сохранивших целостность структуры мембран как сразу после окончания 2-часового воздействия, так и после длительного 3-суточного интервала инкубации при температуре, оптимальной для жизнедеятельности клеточной культуры.

Таблица 1
Результаты подсчета концентрации клеток после воздействия на клеточную культуру цисплатина и диоксидина при температуре 37°С
Действующее вещество	Концентрация физиологически активных клеток в 1 мл	Процент погибших клеток относительно контроля с физ. раствором
По истечении 2 часов инкубации
Цис-платин	620000	29
Диоксидин	520000	40
Хлорид натрия	870000
Через 3 суток инкубации при 37°С
Цисплатин	140000	80
Диоксидин	100000	86
Хлорид натрия	700000

Данные, представленные в Таблице 1, свидетельствуют о том, что инкубация клеток с исследуемыми концентрациями препаратов цис-платина и диоксидина приводит к снижению количества живых клеток. По истечении 2-часового интервала инкубации в исследуемом температурном интервале процент погибших клеток, высчитанный относительно контроля с физиологическим раствором, составляет при коинкубации с цис-платином - 29%, при коинкубации с диоксидином - 40%. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о патогенном воздействии на структуру мембран опухолевых клеток цис-платина и диоксидина. Данные, полученные по истечении 3 суток инкубации при 37°С, демонстрируют увеличение процента погибших клеток в зависимости от времени ко-инкубации с цитостатическими препаратами (для проб с цис-платином - до 80%, для проб с диоксидином - до 86% относительно проб с физиологическим раствором).

В Таблице 2 приведены данные, полученные в результате МТТ-теста, позволяющего оценить ферментативную активность митохондрий клеток. Результаты приведены в виде показателей оптической плотности, снятой при длине волны 560 нм, являющихся прямо пропорциональным показателем ферментативной активности.

Таблица 2
Результаты, полученные в МТТ-тесте при воздействии на клеточную культуру цисплатина и диоксидина
Действующее вещество	Оптическая плотность	Процент погибших клеток относительно контроля с физ. раствором
По истечении 2 часов инкубации
Цисплатин	0.320	38
Диоксидин	0.217	58
Хлорид натрия	0.516
Через 3 суток инкубации при 37°С
Цисплатин	0.181	63
Диоксидин	0.132	73
Хлорид натрия	0.488

Данные, приведенные в Таблице 2, свидетельствуют о негативном воздействии на клеточный метаболизм инкубации клеток с диоксидином и цис-платином. Доля погибших клеток, высчитанная относительно проб, инкубированных с физиологическим раствором, повышается при совместной инкубации с цис-платином - до 38%, с диоксидином - до 58%, что подтверждает выраженное цитотоксическое действие, оказываемое на опухолевые клетки растворами цис-платина (конечная концентрация 1.65·10^-4 М) и диоксидина (0.1% раствор). Величина цитотоксического эффекта тем больше, чем длиннее период совместной инкубации клеток с препаратами. Так, после 2 часов воздействия раствора цис-платина концентрация живых клеток по сравнению с контролем снизилась до 62%, а по истечении 3 суток - до 37%. После инкубации с раствором диоксидина аналогичные показатели оказались более впечатляющими - 42% и 27% соответственно.

С целью изучения воздействия гипертермального фактора проведено исследование, направленное на изучение влияния препаратов диоксидина и цис-платина на физиологическую активность и жизнеспособность клеток аденокарциномы человека линии Colo МТ при различных режимах гипертермии.

В опыте использовалась 5-суточная культура клеток аденокарциномы человека Colo МТ, которую подвергали воздействию повышенных температур в течении 2-часового интервала времени. Контрольная проба в течение того же промежутка времени инкубировалась при температуре 37°С.

Для оценки полученных результатов был подсчитан показатель доли погибших клеток, выраженный в процентах. Доля в каждом опыте рассчитывалась в 2 вариантах: для клеточных проб с диоксидином и цис-платином относительно пробы культуры с физиологическим раствором, инкубируемой в тех же условиях, что и образцы с исследуемыми препаратами; и для проб, подвергавшихся гипертермии, доля высчитывалась относительно контрольных проб с вышеуказанными веществами, инкубированных при 37°С. Первый показатель дает возможность сравнить влияние изучаемых веществ при аналогичных условиях на состояние клеток, а второй демонстрирует суммарное влияние на состояние клеточной культуры опухолевых клеток тестируемых препаратов и повышенных температур.

Таблица 3
Результаты подсчета концентрации клеток после воздействия на клеточную культуру 42 и 43°С (кл/мл)
Температура инкубации, °С	Действующее вещество	Концентрация физиологически активных клеток в 1 мл	Процент погибших клеток
			относительно контроля с физ. раствором	относительно пробы, инкубируемой при 37°С
По истечении 2 часов инкубации при повышенной температуре
37	Цисплатин	620000	29
	Диоксидин	520000	40
	Хлорид натрия	870000
42	Цисплатин	630000	22	0
	Диоксидин	490000	71	6
	Хлорид натрия	810000		9
43	Цисплатин	650000	26	-5
	Диоксидин	500000	35	4
	Хлорид натрия	770000		11
Через 3 суток инкубации при 37°С
37	Цисплатин	140000	80
	Диоксидин	100000	86
	Хлорид натрия	700000
42	Цисплатин	120000	81	14
	Диоксидин	60000	90	40
	Хлорид натрия	620000		11
43	Цисплатин	100000	83	29
	Диоксидин	60000	90	40
	Хлорид натрия	580000		17

Данные, представленные в Таблице 3, свидетельствуют о том, что инкубация клеток с исследуемыми концентрациями препаратов цисплатина и диоксидина в условиях повышенных температур приводит к значительному снижению количества живых клеток. Повышение гипертермального воздействия до 42°С приводит к абсолютному повышению показателя доли погибших клеток относительно контроля с физиологическим раствором (для цис-платина - 22%, для диоксидина - 71% соответственно). Данные, полученные по истечении 3 суток инкубации при 37°С, демонстрируют увеличение процента погибших клеток в зависимости от времени коинкубации с цитостатическими препаратами (для проб с цис-платином - до 83%, для проб с диоксидином - до 90% относительно проб с физиологическим раствором), а также нарастание доли погибших клеток в зависимости от температурного воздействия.

Таблица 4
Результаты, полученные в МТТ-тесте при воздействии на клеточную культуру 42 и 43°С
Температура инкубации, °С	Действующее вещество	Оптическая плотность	Процент погибших клеток
			относительно контроля с физ. раствором		относительно пробы, инкубируемой при 37°С
По истечении 2 часов инкубации при повышенной температуре
37	Цисплатин	0.320	38
	Диоксидин	0.217	58
	Хлорид натрия	0.516
42	Цисплатин	0.264	36			3
	Диоксидин	0.190	54			11
	Хлорид натрия	0.413				20
43	Цисплатин	0.238	36			52
	Диоксидин	0.145	61			32
	Хлорид натрия	0.372				28
Через 3 суток термостатирования при 37°С
37	Цисплатин	0.181		63
	Диоксидин	0.132		73
	Хлорид натрия	0.488
42	Цисплатин	0.193		53		-7
	Диоксидин	0.111		73		15
	Хлорид натрия	0.410				16
43	Цисплатин	0.165		59		8
	Диоксидин	0.105		74		20
	Хлорид натрия	0.402				18

Данные, приведенные в Таблице 4, свидетельствуют о негативном воздействии на клеточный метаболизм инкубации клеток с диоксидином и цисплатином, а также о прогрессирующем снижении активности ферментов при повышении температуры инкубации клеток.

Необходимо отметить, что цитотоксический эффект такого антибактериального препарата, как диоксидин, практически соответствует цитотоксическому эффекту такого распространенного препарата, как цисплатин.

Изучено влияние химиотерапии на жизнеспособность мононуклеарных клеток здорового донора с использованием МТТ-теста, позволяющего оценить сохраненную ферментативную активность митохондрий клеток. Результаты приведены в виде показателей оптической плотности, снятой при длине волны 540 нм, являющихся прямо пропорциональным показателем ферментативной активности.

Таблица 5
Ферментативная активность МНК, полученные в МТТ-тесте
Действующее вещество	Оптическая плотность	Процент погибших клеток
		относительно контроля с физиологическим раствором
По истечении 2 часов инкубации при температуре 37°С
Цисплатин	0.116	61
Диоксидин	0.144	52
Хлорид натрия	0.298

Данные, приведенные в Таблице 5, свидетельствуют о негативном влиянии химиотерапевтического воздействия на мононуклеарные клетки, и особенно о преимущественном токсическом воздействии цисплатина по сравнению с диоксидином (при 37°С процент ферментативно неактивных клеток относительно контроля с физиологическим раствором составлял соответственно 61% и 52%).

Изучение влияния диоксидина, цисплатина, гипертермии на перевиваемость опухолевых клеток опухоли Эрлиха.

Культуру клеток опухоли Эрлиха получали из асцитической жидкости у мышей на 7 сутки после внутрибришинного введения клеток опухоли в дозе 500 тыс.клеток/мышь. Асцитическую жидкость центрифугировали при 1.5 тыс.об/мин и полученный осадок опухолевых клеток ресуспендировали в среде RPMI-1640. Производили подсчет концентрации клеток в 1 мл и исследовали жизнеспособность клеток при помощи метиленового синего. Клетки разливали в стерильные пластиковые флаконы («Costar»). Одна серия флаконов инкубировалась в течение 1 ч в термостате с повышенной температурой -37, 42, 43, 44, 45, 46, 47°С. Во 2-й и 3-й сериях опытов инкубации при отмеченных температурных режимах проводилась в присутствии диоксидина (10 мг/мл) и цисплатина (1.65·10³)M. По истечении указанного периода времени клетки вводили мышам подкожно. Каждая группа состояла из 6 мышей.

Оценку действия препарата на рост опухоли проводили по регистрации различий в скорости роста опухоли. Скорость роста опухоли оценивали по ее объему.

Расчет объема опухоли осуществляли по формуле:

V=ав² (усл.ед)

Объем опухоли измеряли на 30 сутки после перевивки. Результаты исследований представлены в Таблице 6.

У мышей линии СВА при введении 500 тыс. клеток карциномы Эрлиха на 30 сутки после имплантации было отмечено, что диоксидин и цисплатин при инкубации в течение 1 часа с клетками опухоли Эрлиха предупреждали развитие опухолевых узлов при температуре, близкой к жизнедеятельности организма - 37°С, в то время как лишь гипертермальный фактор вызывал достоверное торможение опухолевого роста только после инкубации в течение 1 ч при температуре не менее 45°С.

Таблица 6
Размер опухолевых узлов (усл. ед.) на 30 сутки после имплантации опухоли Эрлиха
Размер опухоли
	Контрольная проба	44	45	46	47
Гипертермия	3200±51	3078±39	0	0	0
Гипертермия + Диоксидин	0	0	0	0	0
Гипертермия + Цисплатин	0	0	0	0	0

Следовательно, термическая обработка оказывает значимое цитостатическое действие на опухолевые клетки только при температуре не менее 45°С. Обработка в течение 1 ч опухолевых клеток цисплатином и диоксидином даже при 31°С полностью предупреждает развитие опухолевых узлов.

Исследование клеточного состава на поверхности операционного поля больных раком прямой кишки

Взятие проб мазков-отпечатков проводилось на последнем этапе оперативного вмешательства, после удаления опухолевых масс и промывки операционной полости 1% раствором диоксидина, перед накладыванием шва. Обезжиренное, стерильное предметное стекло однократно прижимали к поверхности париетального и висцерального листков брюшины, серозной оболочке кишечника, находящихся в границах операционной полости. Полученный таким образом мазок-отпечаток высушивали, фиксировали и окрашивали по Романовскому и по Фельгену. Окрашенный препарат изучался при увеличении ×1000 методом световой микроскопии. Результаты позволяли судить не только о качественном клеточном составе, но и о концентрации подозрительных клеток на поверхности операционного поля после удаления опухолевых масс и всех последующих обработок. Оставшиеся злокачественные клетки, являясь следствием диссиминации опухоли, могут приводить к рецидиву и распространению опухолевого процесса в организме. Согласно вышеприведенной схеме были исследованы мазки-отпечатки, полученные во время операций у 2 больных.

Больной Перебейнос, 65 л., рак прямой кишки T3N×MO : на поверхности мазка обнаружены эритроциты, детрит, а также малодифференцируемые крупные клетки, имеющие признаки опухолевого перерождения - многоядерность, вакуолизацию кариоплазмы и цитоплазмы, выраженную базофилию ядер и цитоплазмы, увеличенный ядерно-цитоплазматический коэффициент, преобладание РНК над ДНК. Таких подозрительных клеток на стекле было обнаружено 16. Исходя из того, что площадь мазка составляла 30×15 мм, можно высчитать примерную частоту встречаемости тестируемых клеток на поверхности операционного поля. Для данного, случая она составляла 3.6 клетки на 1 мм² поверхности.

Больной Быкович, 48 л, рак прямой кишки : на мазке, имеющем площадь ˜20×20 мм, при исследовании было обнаружено лишь незначительное количество эритроцитов.

Исследование клеточного состава 1% раствора диоксидина после промывания им операционной полости

Было проведено исследование клеточного состава жидкости, полученной после заключительного промывания брюшной полости 1% раствором диоксидина больных Перебейноса и Быковича. Жидкость центрифугировали в пластиковой пробирке объемом 50 мл при 20°С 600 g в течение 15 мин. После отбора супернатанта осадок ресуспензировали пипеткой, окрасили в соотношении 1:1 1% раствором трипанового синего и поместили для подсчета в камеру Горяева. В изучаемых пробах не было найдено ни одной целостной клетки. Исследование патологического материала проводилось через 2-3 ч после его получения. Вероятно, именно это обстоятельство привело к тому, что в обоих случаях за период времени, прошедший с момента отбора проб до ее исследования, раствор диоксидина лизировал все тканевые и бактериальные клетки и истинный клеточный состав жидкости остался нам неизвестен.

Таким образом, проведенными экспериментами показано, что антибактериальный препарат диоксидин, применяемый в клинической практике для обработки раневых и операционных поверхностей, проявляет такое же цитотоксическое действие на клетки аденокарциномы, как цисплатин, взятые в концентрациях: цисплатин 50 мг/кг, диоксидин 0.1% раствор. Время контакта - 90 мин; интервал температур 37-45°С.

О жизнеспособности клеток судили по содержанию активных клеток в исследуемой суспензии, подсчет которых производили в камере Горяева. Результаты свидетельствуют, что при концентрациях диоксидина 0.6-0.8% число активных клеток аденокарциномы снижается практически до нуля уже при 37°С и времени контакта 90 минут. При концентрации диоксидина выше 0.8% наблюдается уже полное разрушение клеток в течение короткого промежутка времени (5-10 мин).

С повышением температуры в присутствии диоксидина гибель активных клеток наступает раньше: при 44°С она наступает уже в присутствии 0.4% диоксидина

Параллельно в этих же пробах методом ЭПР-зондов смотрели изменение структурного состояния мембран клеток аденокарциномы. Выявлено, что с ростом концентрации диоксидина жесткость мембраны «S» растет и при концентрациях 0.15-0.20% график зависимости выходит на плато. Это говорит о том, что в мембране наступает необратимое нарушение жизнедеятельности отдельных элементов клетки.

С повышением температуры в присутствии диоксидина деструктивные превращения в клетке наступают раньше При концентрации диоксидина 0.8% кривая выходит на плато при 42°С, в то время как в его отсутствии - при 44°С.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показали, что бактерицидный препарат диоксидин обладает достаточно выраженными противовопухолевыми свойствами, не уступающими, а даже несколько превосходящими аналогичные свойства цисплатина, в то же время с меньшими токсическими эффектами на здоровые клетки. Все вышеуказанное, равно как и низкая себестоимость препарата, во много раз меньшая в сравнении с современными цитостатиками, открывают препарат «Диоксидин» в качестве перспективного противоопухолевого средства.