препарат для очистки почв от мышьяка и защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, и штамм бактерий pseudomonas aureofaciens bkm b-2390 д для его получения

Формула изобретения

1. Препарат для очистки почв от мышьяка и защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, включающий суспензию клеток штамма бактерии Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д.

2. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKMB-2390 Д для очистки почв от мышьяка и защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д, обладающего способностью подавлять рост фитопатогенных грибов родов Alternaria, Fusarium, Rhizoctonia, Phytophthora, Gaeumannomyces и устойчивого к мышьяку, который может быть использован для получения бактериального препарата для защиты растений от фитопатогенов и очистки почв от мышьяка.

Известен штамм вида Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-4117, предназначенный для защиты растений от грибных и бактериальных патогенов (SU №1482188, кл. C12N 1/20, 1994 г.).

Однако целевое применение этого штамма ограничено, поскольку он предназначен для защиты только винограда.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 (RU №2203945, кл. C12N 1/20, 1994 г.), предназначенный для защиты сельскохозяйственных растений от возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями.

Известен также окисляющий мышьяк штамм Pseudomonas putida 18 (SU 844630, кл. C12N 1/00, 1981 г.) предназначенный для очистки сточных вод от мышьяка.

Однако эти два штамма имеют более узкий круг супрессируемых фитопатогенов по сравнению с заявляемым штаммом и более узкую область применения: штамм Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 предназначен для борьбы с заболеваниями пшеницы, а штамм Р. putida 18 - только для очистки воды от мышьяка.

Во всех перечисленных выше документах нет сведений о способности штаммов стимулировать рост растений на загрязненных мышьяком почвах и увеличивать накопление мышьяка растениями, что способствует очистке почв от загрязнителя.

Задачей изобретения является получение нового штамма Pseudomonas aureofaciens и создание на его основе препарата для защиты растений и очистки почв от мышьяка.

Техническим эффектом, который может быть получен при использовании предлагаемого штамма и препарата, полученного на его основе, является способность к подавлению роста широкого круга фитопатогенных грибов, стимуляция роста растений и устойчивость к мышьяку.

Предлагается штамм Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д, выделенный из ризосферы люцерны Краснодарского края, с использованием селективной агаризованной среды Кинга В. Основными критериями отбора служили растворение фосфатов, стимуляция роста растений и подавление роста фитопатогенных грибов из родов Alternaria, Fusarium, Rhizoctonia, Phytophthora, Gaeumannomyces.

Предлагаемый штамм обладает способностью растворять фосфаты. В почве фосфор, как правило, находится в нерастворимой форме (фосфаты), что уменьшает его доступность растениям. Штаммы, растворяющий фосфаты, делает его более доступным для растений, тем самым улучшая их питание.

Предлагаемый штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens KR31 (pKS1) в коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид имеет номер BS1501, он депонирован под номером ВКМ В-2390 Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина (г.Пущино, Московской обл., пр. Науки, 5).

Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки

Клетки подвижные, палочковидные, с полярными жгутиками, грамотрицательные, спор не образуют.

Штамм хорошо растет на следующих средах: LB (триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлористый натрий - 10 г/л, рН 7,2), Кинга Б пептон - 20 г/л, глицерин - 10 мл/л, MgSO₄×7H₂O - 1,5 г/л), на минимальной синтетической среде М9 следующего состава: К₂HPO₄ - 7 г/л, КН ₄PO₄ - 3 г/л, NH₄ Cl - 1 г/л, глюкоза - 2 г/л.

Морфологию колоний на питательных средах определяют после 3-4 суток роста при 28°С. Колонии на среде LB непрозрачные, круглые, плоские, гладкие, выпуклые к центру, ярко-оранжевые, не слизистые, диаметр 3-4 мм. Пигмент желто-оранжевый, диффундирующий в среду. Под ультрафиолетом зона вокруг колоний флуоресцирует зеленым светом. При выращивании на среде Кинг Б образуется желто-зеленый флюоресцирующий пигмент. В жидких питательных средах (LB) образуется тонкая, сплошная пленка. Через сутки культивирования в среду выделяется желтый пигмент, через 3 суток среда окрашивается в красно-оранжевый цвет. На LB-косяках штрих обильный, сплошной с ровным краем.

Физиолого-биохимические признаки

Облигатный аэроб, температурный оптимум роста 28-30°С, не растет при 41°С; растет в пределах рН среды от 5.2 до 8.0.

В дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф). Метаболизм глюкозы окислительный. Желатина - быстрое разжижение. Послойное разжижение начинается через 24 ч, полное наблюдается на третьи сутки (28°С). Молоко пептонизирует, образует желто-зеленый пигмент. Молекулярный азот не фиксирует. Крахмал не гидролизует. Клетчатку не разлагает. Пектиназная активность отсутствует. Продуцирует каталазу, образует аргининдигидролазу. Гидролизует лецитин.

Отношение к источникам углерода

Усваивает с образованием кислоты глюкозу, фруктозу, трегалозу, маннит, глицерин. Не усваивает арабинозу, ксилозу, рамнозу, галактозу, мальтозу, лактозу, сорбит, дульцит. Из органических кислот усваивает муравьиную, уксусную, молочную, янтарную, фумаровую, пировиноградную, яблочную, бензойную. Не усваивает винную, лимонную, щавелевую, глюконовую кислоты.

Отношение к источникам азота

Использует аммиачные и нитратные соли азота в качестве единственного источника азота.

Сапрофит. Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Устойчивость к антибиотикам

Штамм проявляет устойчивость к стрептомицину (200 мкг/мл), ампициллину (200 мкг/мл), новобиоцину (100 мкг/мл) и карбинициллину (100 мкг/мл).

Устойчивость к мышьяку

Штамм устойчив к мышьяку в высоких концентрациях 100-1000 млг/л. Штамм обладает способностью растворять фосфаты (см. чертеж).

Генетические признаки

Штамм содержит сконструированную плазмиду, устойчивую к мышьяку pKS1. Данная плазмида была получена следующим образом.

Фрагмент ДНК, полученный в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР), содержащий оперон устойчивости к мышьяку, был амплифицирован с праймеров для арсенитного оперона с хромосомы штамма Pseudomonas aeruginosa PA01. Данный оперон arsRBC содержит три гена, обуславливающие устойчивость к мышьяку. Полученный в ходе ПЦР фрагмент ДНК (размером около 2200 тысяч пар нуклеотидов) был клонирован в челночном векторе pUCP22 (E.coli - Pseudomonas sp., Ap^r , Gm^r 4729 пар нуклеотидов) по сайтам эндонуклеаз рестрикции, искусственно введенным в последовательности праймеров. В результате клонирования была получена плазмида устойчивости к мышьяку pSK1 (6920 п.н.) (Сизова с соавт. Прикл. биохим. и микробиол., 2004, Т. 40, №1, с.78-82).

Полученная генетическая конструкция была трансформирована в штамм Pseudomonas aureofaciens KR31. В результате трансформации был получен устойчивый к мышьяку штамм Pseudomonas aureofaciens KR31 (pKS1), депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-2390 Д. Плазмида стабильно поддерживается в штамме.

Условия хранения

Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д хранят на чашках или косяках с LB или со средой Кинга Б и мышьяком в концентрации 500 мкг/мл при 5-7°С. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Может храниться не менее 6 месяцев на минимальной синтетической среде М9 с мышьяком не менее 1 года в 15% глицерине при -20°С, в полужидкой агаризованной среде с мышьяком под вазелиновым маслом следующего состава: Nutrient Broth (Difco) - 4 г/л, NaCl - 5 г/л, агар - 6 г/л, рН 6,8.

У штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д отсутствует фитотоксичность. Показатели фитотоксичности штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д имеют отрицательные значения (Таблица 1), свидетельствующие о наличии стимулирующего рост растений эффекта.

Штамм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д угнетает рост следующих фитопатогенных грибов: Alternaria brassicae, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Fusarium maniliforum, Fusarium graminearum, Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Gaeumannomyces graminis (Таблица 2).

Получение препарата для защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами на основе штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д осуществляют следующим образом:

выращенную культуру бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д осаждают центрифугированием. Затем культуру разводят раствором 0,01М сульфата магния до конечного титра бактерий 1×10 ⁸ кл/мл.

Полученный препарат в виде суспензии клеток используют для инокуляции семян. В отдельных случаях при обработке семян с гладкой поверхностью (например, сорго, рапс, кукуруза) необходимо вносить в препарат вещество, обеспечивающее адсорбцию бактерий на семенах.

Растения, выращенные из инокулированных семян, характеризуются лучшей выживаемостью на почвах, загрязненных мышьяком. Это важно при очистке почв от мышьяка.

Возможность осуществления изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Получение культуры бактерий для обработки семян

В пробирку, содержащую 5-10 мл жидкой среды LB, стерильно вносят одну отдельную колонию штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д с агризованной среды LB с мышьяком. Перемешивают, помещают на качалку и выращивают в течение 15 часов при температуре 30°С. Затем в колбу емкостью 750 мл наливают 250 мл стерильной жидкой среды LB с мышьяком (250-300 мг/л), вносят 5 мл 15-часовой культуры штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д, помещают на качалку и выращивают 15-17 часов при температуре 30°С.

Пример 2. Получение препарата для защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами

Выращенную в течение 15-17 часов при температуре 30°С культуру Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д осаждают цетрифугированием в течение 15 мин при 5 тыс. об/мин. Затем культуру разводят раствором 0,01М сульфата магния до конечного титра бактерий 1×10 ⁸ кл/мл. Полученный препарат в виде суспензии клеток используют для инокуляции семян.

Пример 3. Демонстрация отсутствия фитотоксичности у штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д

Суспензию клеток бактерий штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д для испытаний готовят следующим образом: в колбу емкостью 750 мл наливают 250 мл стерильной среды LB с мышьяком, вносят 1-2 мл стационарной культуры исследуемого штамма и выращивают на качалке (250 об/мин) при 30°С в течение 24 ч до конечного титра 1×10⁸ кл/мл, в которой на 2 ч замачивают семена пшеницы "Память Федина".

В контрольном опыте семена замачивают в дистиллированной воде.

По 50 семян каждого варианта раскладывают на увлажненную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, которую помещают в чашки Петри, и выдерживают в термостате при 28°С в течение 5 суток, постоянно увлажняя.

Через сутки оценивают всхожесть семян (Таблица 1), а через 5 суток проростки морфометрируют, измеряя длину основного корня и стебля.

Фитотоксическую активность штамма рассчитывают по формуле

А=(100-Д₀/Д _к 100)%,

где А - показатель фитотоксичности;

Д₀ - средний показатель параметра в опыте;

Д_к - средний показатель параметра в контроле.

Фитотоксичными считаются те штаммы, показатель фитотоксичности которых превышает 30%. Отрицательные значения показателя А свидетельствуют о стимулирующем эффекте.

Показатели фитотоксичности штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д имеют отрицательные значения (см. таблицу 1), свидетельствующие о наличие стимулирующего эффекта.

Пример 4. Демонстрация способности штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д растворять фосфаты

Для эксперимента подготавливают следующую минеральную среду: на 1 л MgSO₄+7H₂ O - 2 г, NaCl - 1 г, NH₄Cl - 10 г, Агар - 15 г, Трис аминометан - 2 г. 40% раствор глюкозы готовим и стерилизуем отдельно, добавляем перед разливом в среду (10 г/л). рН среды 7,2.

Готовят раствор гидроксилапатит (ГАП). Используют 5 г ГАП. Отмывают деионизованной водой 15 раз. Высушивают на бумажном фильтре. Растирают в ступке до гомогенного состояния. Стерилизуют в 200 мл деионизованной воды (30 мин на 0.5 атм). Стерильно сливают воду до 50 мл.

Расплавляют готовую минеральную среду. Добавляют глюкозу в концентрации 1%. Предварительно взболтав до густой взвеси, разливают в пробирки 1 мл раствора ГАП. Добавляют в каждую из пробирок по 20 мл горячей среды. Взбалтывают на миксере и выливают в чашки Петри.

Предварительно выращивают свежую культуру бактерий в жидкой среде LB в течение 15-18 часов. На подготовленные чашки с ГАП осторожно стерильной пипеткой капают 5 мкл культуры бактерий и затем инкубируют 3 суток при температуре 30°С.

Вокруг колоний появляется зона просветления, что подтверждает способность штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д растворять фосфаты (см. чертеж).

Пример 5. Демонстрация антагонизма штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д в отношении фитопатогенных грибов

В качестве индикаторного тест-объекта используют штамм гриба Gaeumannomyces graminis var. tritici 1818.

Штамм бактерий выращивают в жидкой среде LB до плотности 10⁸ кл/мл. На чашку Петри с агаризованной средой Каннера сеют бактериальный штамм Р. aureofaciens BKM В-2390 Д (пятном диаметром 5 мм на расстоянии 3-3,5 см от центра чашки) из суспензии и выращивают в течение 2 суток для достижения полного синтеза вторичных метаболитов. Затем в центр чашки Петри на поверхность питательного агара помещают сегмент мицелия (диаметром 9 мм) грибного штамма Gaeumannomyces graminis var. Tritici 1818, вызывающего офиоболезную гниль корней пшеницы.

Мицелий для этого эксперимента выращивают на сусло-агаре при комнатной температуре в течение 7 суток. Чашки Петри заклеивают парафильмом для поддержания необходимой влажности и инкубируют при комнатной температуре в течение 5-7 суток.

Наличие зоны подавления роста мицелия G. graminis var. tritici 1818 штаммом свидетельствует об антагонистической активности бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д в отношении указанного фитопатогенного гриба.

Аналогично описанному продемонстрирован антагонизм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д к ряду фитопатогенных грибов.

Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390Д угнетает рост следующих фитопатогенных грибов: Alternaria brassicae, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Fusarium maniliforum, Fusarium graminearum, Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Gaeumannomyces graminis (Таблица 2).

Пример 6. Демонстрация антагонизма штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д в отношении фитопатогенных грибов на среде с мышьяком

Культивирование осуществляют аналогично примеру 5, но в среду Каннера добавляют мышьяк (арсенит натрия) до конечной концентрации 500 мкг/мл. В качестве тест-объекта используют штамм гриба Fusarium graminearum.

Наличие зоны подавления роста гриба у штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д свидетельствует об антагонистической активности данного штамма в условиях загрязнения среды мышьяком. Аналогично описанному продемонстрирован антагонизм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д к ряду фитопатогенных грибов.

Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д в условиях загрязнения среды мышьяком угнетает рост следующих фитопатогенных грибов: Alternaria brassicae, Fusarium oxysporum, Fusarium maniliforum, Fusarium graminearum, Phytophthora infestans, Fusarium heterosporum, Rhizoctonia solani, Gaeumannomyces graminis (Таблица 3).

Пример 7. Демонстрация стимулирующего влияния препарата, содержащего штамм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д на накопление мышьяка растениями сорго

Суспензию клеток штаммов Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д для испытаний готовят, как описано в примере 2, до конечного титра 1×10⁸ кл/мл. Добавляют в суспензию клеток водный раствор метилцеллюлозы до конечной концентрации 1%. Используют стерильный 10% раствор метилцеллюлозы. В этом растворе на 2 ч замачивают семена сорго сорта "Пищевое 227". В контрольном опыте семена замачивают в дистиллированной воде.

Почву для эксперимента просеивают через сито с ячейками 2 мл. В сосуд (горшок) помещают 500 г почвы и добавляют раствор мышьяка до конечной концентрации 100 мг/кг. По 10 инокулированных семян сорго «Пищевое 227» каждого варианта помещают подготовленную почву. В качестве контроля используют варианты с обработкой семян бесплазмидным штаммом Pseudomonas aureofaciens KR 31 и стерильной водой.

Растения выращивают в течение месяца и затем измеряют содержание мышьяка в растениях. Из Таблицы 4 видно, что растения, обработанные препаратом, содержащим штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д, накапливают в два раза больше мышьяка, чем контрольные растения, не инокулированные бактериями.

Таким образом, предложен препарат, содержащий штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390 Д. Штамм устойчив к мышьяку, обладает способностью к подавлению роста широкого спектра фитопатогенных грибов (Alternaria, Fusarium, Phytophthora, Gaeumannomyces и Rhizoctonia), основных возбудителей болезней зерновых культур и картофеля в присутствии/отсутствии мышьяка. Кроме того, он растворяет фосфаты, что улучшает его доступность для растений.

Штамм не токсичен для растений в рекомендуемых для обработок концентрациях, стимулирует рост растений и может быть рекомендован для профилактической обработки семян технических культур (сорго, подсолнечник), для очистки почв от мышьяка.

При увеличении накопления мышьяка растениями (как минимум в два раза больше мышьяка, чем контрольные растения, не обработанные предлагаемым препаратом) ускоряется очистка почв от загрязнителя.

Таблица 1. Показатели фитотоксичности штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д для проростков пшеница сорта «Память Федина»
Вариант обработки клеток	Показатель фитотоксичности, %
	Корень	Стебель
Дистиллированная вода	0	0
Суспензия клеток Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д	-15.4	-25.2

Таблица 2. Антагонистическая активность штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д в отношении фитопатогенных грибов
Гриб-патоген	Заболевание	Антагонистическая активность
Alternaria brassicae	Альтернариоз	+
Fusarium oxysporum	Корневе гнили	+
Fusarium heterosporum	Листовые пятнистости	++
Fusarium maniliforum	Листовые гнили	+
Fusarium graminearum	Фузариоз	++
Phytophthora infestans	Фитофтороз	++
Rhizoctonia solani	Ризоктониоз	++
Gaeumannomyces graminis var. tritici 1818	Офиболезные гнили корней пшеницы	++
Gaeumannomyces graminis var. tritici 19 (2)	Офиболезные гнили корней пшеницы	+
Gaeumannomyces graminis PIT	Офиболезные гнили корней пшеницы	+
+ Зона угнетения роста мицелия гриба в месте соприкосновения с бактериальным штаммом
++ Обширная зона угнетения роста мицелия гриба в месте соприкосновения с бактериальным штаммом и в сопредельной области

Таблица 3. Антагонистическая активность штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390 Д в отношении фитопатогенных грибов на среде с мышьяком (500 мг/л)
Гриб-патоген	Заболевание	Антагонистическая активность
Alternaria brassicae	Альтернариоз	+
Fusarium oxysporum	Корневые гнили	+
Fusarium heterosporum	Листовые пятнистости	+
Fusarium maniliforum	Листовые гнили	+
Fusarium graminearum	Фузариоз	++
Phytophthora infestans	Фитофтороз	+
Rhizoctonia solani	Ризоктониоз	++
Gaeumannomyces graminis var. tritici 1818	Офиболезные гнили корней пшеницы	+
Gaeumannomyces graminis var. tritici 19 (2)	Офиболезные гнили корней пшеницы	++
Gaeumannomyces graminis PIT	Офиболезные гнили корней пшеницы	+
+ Зона угнетения роста мицелия гриба в месте соприкосновения с бактериальным штаммом
++ Обширная зона угнетения роста мицелия гриба в месте соприкосновения с бактериальным штаммом и в сопредельной области

Таблица 4. Влияние различных вариантов штамма Pseudomonas aureofaciens KR31 на накопление мышьяка растениями
Вариант опыта	Содержание мышьяка в почве, мг/кг сухого веса	Содержание мышьяка в растениях, мг/кг сухого веса
Контроль (неинокулированные растения)	45.8	51.2
Pseudomonas aureofaciens KR31	50.5	48.5
Pseudomonas aureofaciens BKM B-2390 Д	30.06	110.57