способ получения фармацевтического препарата, обладающего антимикробным действием

Формула изобретения

1. Способ получения фармацевтического препарата, обладающего антимикробным действием, включающий мойку червей, освобождение их от содержимого кишечника, разрезание живых червей на кусочки 2-3 см и последующую сушку червей, отличающийся тем, что дождевого червя до разрезания перед сушкой предварительно подвергают активации, сушат около сут в хорошо проветриваемом месте, затем около 5-10 ч в сушильном шкафу при 50±5°С, затем высушенных червей измельчают до порошкообразного состояния.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что активацию производят предварительным помещением червей в водную суспензию с высоким титром непатогенного штамма Yarrovia lipolitica на 30-60 мин с последующим отмыванием их в нескольких подкисленных водах.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что активацию производят предварительным помещением червей в морозильную камеру в емкости с водой на 20-30 мин, избегая заледенения, с последующим отогреванием их до комнатной температуры.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, точнее к способу получения иммунологически активных веществ - фармацевтических препаратов из дождевых червей. Эти препараты эффективны при лечении инфекций, геронтологических, онкологических, функциональных и многих других заболеваний. Своим лечебным действием они обязаны уникальной иммунной системе дождевого червя, сформировавшейся в ответ на экстремальные условия среды обитания. Иммунная система дождевого червя представлена множеством специфических иммунных клеток, антибиотической, ферментативной системой, системой комплементарных белков, локализованных в основном в целомической жидкости.

Известен способ получения иммуностимулятора /Патент РФ №2091072, А61К 35/50, 1979 г./, в котором ганглии кальмара или каракатицы гомогенизируют в воде, подкисленной уксусной кислотой до рН 3,5-4,5 и содержащей 0,1% хлористого цинка. Смесь выдерживают 28-48 ч. После отделения надосадочной жидкости ее подвергают стерилизующей фильтрации. Стерильный фильтрат концентрируют в 5,5 раз методом ультрафильтрации через пористый материал с пределом разделения 1000-5000 Д и подвергают очистке в трехкратном объеме подщелоченной до рН 9,0-10,0 воды. Очищенный концентрат снова концентрируют в 2 раза на том же пористом материале и подвергают стерилизующей фильтрации. Затем проводят стерильный розлив препарата и лиофильно высушивают.

Известен способ получения препарата "Dilongjing" /Патент CN 1114202, А61К 35/64; А61К 35/56; 1996 г./, включающий мойку живых земляных червей, разделение центрифугированием, замораживание сухим вакуумом, чтобы получить сухой порошок, и загрузку в капсулы, или смешивание с медом, чтобы получить жидкость для принятия во внутрь.

Известен способ получения терапевтического медикамента для тромбоза /Патент США №5,186,944, А61К 35/56, 1993 г./. Способ включает чистку живых земляных червей от грунта (грязи) на поверхности тела и фекальной грязи в пищеварительном тракте, размещая червей в кислотном водном растворе, имеющем водородный показатель от 3 до 6.5 для от 0.1 до 5 часов; помещение в сосуд, который замораживают при температуре от -10°С до -60°С. С последующей сушкой сублимацией при этой температуре от 5 до 12 часов под вакуумом, вакуумную сушку осуществляют ступенчато от 5 до 15 часов при 20 - 30°С, при 0.01, 0.2 мм рт.ст., от 10 до 20 часов при 35 - 50°С, при 0.1-0.5 мм рт.ст. и от 0.1 до 19 часов при 70 - 80°С, при 0.001-5 мм рт.ст.

Известен способ получения сухого порошка из дождевых червей и антигиперлипемического, антидиабетического, антигипертонического и антигипотонического препаратов, содержащих сухой порошок дождевых червей в качестве активного ингредиента /Патент США №5024844, А61К 35/56, 1991 г./. Разновидность живых земляных червей помещают в пресной воде при содержании водного раствора не больше чем 0.3% по массе, предпочтительно не больше чем 0.1% по массе, по крайней мере одного состава, выбранного от органических кислот типа уксусной кислоты, лимонной кислоты, янтарной кислоты, яблочной кислоты, винной кислоты и молочной кислоты; минеральные кислоты типа фосфорной кислоты, серной кислоты и соляной кислоты; и натрий или калийные соли этих кислот на время от 0.5 до 72 часов, предпочтительно от 1 до 40 часов. Вышеуказанный раствор может также быть характеризован как слегка кислотный водный раствор, имеющий водородный показатель от 3 до 6.5. Таким образом пищеварительный тракт живых земляных червей в основном освобожден от почвы (грунта). Тогда живые земляные черви вымыты с водой, чтобы удалить любой грунт (грязь) из поверхностей тела. После этого, живые влажные дождевые черви помещаются при низкой температуре -5°С или ниже, предпочтительно -10°С-60°С. Затем закрепляемую подвеску высушивают замораживанием и высушивают вакуумом, от 10 до 60 часов. Таким образом получен стерильный (бесплодный) высушенный порошок земляного червя. Высушенный порошок земляного червя содержит приблизительно 18 аминокислот, включая аспарагиновую кислоту, треонин, серин (альфа-амино-бета-оксипропионовую кислоту), глутаминовую кислоту, пирролидин-альфа-карбоновую кислоту, глицин, аланин, цистеиновый, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, триптофан, лизин, гистидин.

Ближайшим аналогом является способ получения фармацевтических препаратов из дождевых червей /Вторая Международная научно-практическая конференция "Дождевые черви и плодородие почв", 17-19 марта 2004, Владимир, Россия. Ковров, изд-во "X-PRESS", 2004, 293 с. (далее [1]), SUN ZHENJUN Фармацевтическая ценность и использование дождевых червей в Китае, стр.49/. Собранных дождевых червей режут на кусочки 1-2 см, смачивают водой полминуты и промываются в воде 1-2 минуты, а полученную массу сушат на сильном солнце. Высушенных червей помещают в деревянную коробочку и хранят в вентилируемом месте.

Недостатком известных способов является сложность приготовления препаратов и их недостаточно эффективные антимикробные свойства.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа получения фармацевтического препарата из дождевых червей, позволяющего получить препарат с более эффективными антимикробными свойствами.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения активированных фармацевтических препаратов, включающем мойку червей, освобождение их от содержимого кишечника, разрезание живых червей на кусочки длиной 2-3 см и последующую сушку, дождевого червя до разрезания перед сушкой предварительно подвергают активации, сушат около суток в хорошо проветриваемом месте, затем около 5-10 часов в сушильном шкафу при 50±5°С, затем высушенных червей измельчают до порошкообразного состояния.

Активацию производят предварительным помещением червей в водную суспензию с высоким титром непатогенного штамма Yarrowia lipolytica, на 30 - 60 минут, с последующим отмыванием их в нескольких подкисленных водах.

Активацию производят предварительным помещением червей в морозильную камеру в емкости с водой на 20 мин.

Иммунная, антимикробная и ферментативная системы дождевого червя обладают способностью увеличивать свою эффективность под воздействием как неблагоприятных факторов окружающей среды, так и благоприятных в том числе. Для получения активированных фармацевтических препаратов необходимо подвергнуть некоторым манипуляциям дождевых червей - сырье для получения препаратов.

Способ осуществляется следующим образом:

Червей, взятых из почвы, тщательно промывают в нескольких стерильных водах. Выдерживают в течение суток голодом в 0,5 л банках с влажной фильтровальной бумагой для освобождения кишечника от почвенных комочков. Затем дождевого червя предварительно подвергают активации. После этого живых червей разрезают на кусочки длиной 2-3 см, сушат около суток в хорошо проветриваемом месте, затем около 5-10 часов в сушильном шкафу при 50±5°С. Высушенных червей измельчают в стерильной сухой ступке до получения порошка. Полученный препарат хранят в холодильнике в плотно укупоренных флаконах.

Активацию производят двумя способами.

Первый способ заключается в том, что половозрелые особи дождевого червя Eisenia fetida Andrei Bouche помещают в водную суспензию с высоким титром непатогенного штамма Yarrowia lipolytica, на 30-60 минут, затем отмывают их в нескольких подкисленных водах.

Второй способ заключается в том, что дождевых червей помещают в морозильную камеру в емкости с водой на 20-30 минут при объеме воды 50 мл, избегая заледенения. Затем червей отогревают до комнатной температуры.

Оценка изменения эффективности препарата в сравнении с обычным проводится с использованием метода дисков:

В чашках Петри на специфическую питательную среду наносят густые суспензии данного патогенного микроорганизма, родственного непатогенного или условно патогенного, или сходного по устройству микроорганизма в объеме 0,5 мл, чтобы в дальнейшем получить сплошные газоны данных культур (например, РПА (рыбо-пептонный агар) для Staphylococcus sp.)).

Спустя 30 минут, когда субстраты подсохли, накладывают на субстрат стерильные бумажные диски, диаметром 0,5 см, пропитанные суспензией препаратов контрольных и активированных на физ. растворе. Для приготовления суспензии берут 30 мг препарата и 0,3 мл физ. раствора.

По прохождении 30 минут чашки переворачивают, помещают в термостат и культивируют при температуре 31°С. На следующие сутки смотрят полученные результаты: в зонах, где протекали бактериостатические реакции, наблюдали неравномерный, слабый рост бактериального газона. Опыт проводят минимум в 3 повторностях с вычислением доверительного интервала.

Измеряют радиус подавления роста бактериального газона от центра диска максимальный и минимальный, находят среднее значение. Сравнивают радиусы, полученные у контрольных и активированных препаратов. По разнице судят о наличии эффекта активации /Ревю по антибактериальному иммунитету дождевых червей. Ванг Чонг, Женг Донг Мэй, Сун Женджун. Материалы 2-ой Международной научно-практической конференции «Дождевые черви и плодородие почвы» во Владимире, 17-19 марта 2004 года/.

В таблице показаны изменения эффективности препарата в сравнении с обычным (контроль), приготовленным по традиционной (без наших модификаций) методике.

Контролем в нашем случае был препарат сухого порошка из дождевых червей, приготовленный по традиционной методике, но без предварительной активации. Анализируя данные таблицы, видно, что активированные препараты на основе дождевого червя (препарат 2, 3) более активно подавляют рост газонов культур, чем контрольный препарат 1. Причем наибольшей чувствительностью к действию препаратов обладают такие тест-культры, как Y. lipolytica и Staphylococcus sp., по признаку четкости зоны подавления роста газона вокруг бумажного диска: зоны четкие, хорошо просматриваемые. Такая особенность тест-культур очень важна при различных методах оценки.

Таблица
Газонообразующая микробиологическая культура	Препарат №1, контроль	Препарат №2, активация охлаждением	Препарат №3, активация Staphylococcus sp.
	Радиус зоны отсутствия роста бактериального газона (от центра диска), мм
Yarrowia lipolytica	5±0,75 (3-и сутки),	18±2,5 (3-и сутки),	14±2,38 (3-и сутки),
	15±2,2 (6-е сутки)	38±5,7 (6-е сутки)	40±6,4 (6-е сутки)
Pseudomonas aeruginosa	11±1,5	30±4,8	-
Staphylococcus sp.	10±1,7	42±6,3	37±5,8
Rhodococcus elitropolis	6±0,8	35±5,2	35±5,6
Bacillus thuringiensis	18±2,3	15±2	20±2,8

Также можно сказать, что самым эффективным методом активации антимикробных свойств дождевых червей является охлаждение: радиусы зон подавления роста газонов всех тест-культур под влиянием препарата 3 (охлаждение) самые большие по сравнению с действием остальных препаратов на тех же газонах.

Препарат, полученный после активации нагреванием, эффективнее контрольного препарата, но в ряду активированных препаратов самый слабый. Это связано скорее всего с тем, что температура - фактор не активирующий, а угнетающий для дождевых червей. В работах других авторов /Н.В.Кузьмина, Н.Е.Кощенкова, Е.Н.Кубарев, Г.А.Осипов. Материалы 2-ой Международной научно-практической конференции «Дождевые черви и плодородие почвы» во Владимире, 17-19 марта 2004 года/ приведены данные о длительном влиянии повышенных температур на дождевых червей, приводящем к снижению их антимикробных свойств и увеличению доли патогенных микроорганизмов в структуре микробного сообщества кишечного тракта дождевых червей.

Наибольшей чувствительностью к действию всех препаратов обладает Staphylococcus sp., наименьшей - R. elitropolis и В. thuringiensis.

При проведении опыта было отмечено хорошо выраженное бактериостатическое действие препарата - активация стафилококком на газонах с Yarrowia lipolytica. Чтобы доказать, что данный препарат подавляет рост газона за счет собственных антимикробных свойств, а не за счет антагонистических взаимодействий между Yarrowia lipolytica и St. sp, была проведена проба на антагонизм. Она оказалась отрицательной (смотри чертеж). Так же производили высев суспензии препарата 1 (активация стафилококком) на РПА с целью обнаружить присутствие St. sp в препарате: St. sp не высеялся.

Препараты, полученные из дождевых червей, подвергшихся медленному охлаждению: в течение 20-30 минут в емкости с водой в морозильной камере, проявили самые сильные антимикробные свойства в отношении В. thuringiensis, R. erythropolis, Staphylococcus sp. P. aeruginosa, Yarrowia lipolytica в сравнении с контрольным препаратом и на уровне препарата, активированного Staphylococcus sp.

Так как стафилококк - условно патогенный штамм, предлагаем заменить его на непатогенные Y. lipolytica - нетоксичные дрожжи, продуцент нефтеразрушающего препарата «Девороил».

Предлагаемый способ позволяет получить препарат с более эффективными антимикробными свойствами и упростить способ его получения.