способ определения 2,6-бис-[бис-(бета-оксиэтил)-амино]-4,8-ди-n-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в биологическом материале

Формула изобретения

Способ определения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемую пробу измельчают, неоднократно настаивают с органической жидкостью, полученные органические извлечения объединяют, анализируемое вещество переводят в раствор с сильно-кислой реакцией среды, раствор промывают эфиром, подщелачивают до щелочной реакции среды, экстрагируют гидрофобным органическим растворителем с последующим отделением экстракта, испарением экстрагента и определением анализируемого вещества в остатке, отличающийся тем, что настаивание проводят с ацетоном двукратно каждый раз в течение 30 мин, после объединения ацетоновых извлечений ацетон испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в хлороформе, для переведения анализируемого вещества в раствор с сильно-кислой реакцией среды хлороформный раствор экстрагируют 0,1 н. раствором хлороводородной кислоты, после подщелачивания кислого раствора его насыщают хлоридом натрия, в качестве гидрофобного органического растворителя для экстракции применяют этилацетат, после испарения экстрагента остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты, взятых в соотношении 8:2 (по объему), хроматографируют в колонке с сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм с использованием подвижной фазы ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют и измеряют оптическую плотность элюата при длине волны 286 нм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо (5,4-d)пиримидина в биологическом материале, и может быть использовано в практике химико-токсикологических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в биологических объектах путем измельчения биологической ткани, двукратного настаивания с водой, подкисленной щавелевой кислотой, отделения извлечений, их объединения, фильтрования объединенного извлечения, экстракции анализируемого соединения хлороформом после подщелачивания раствора, отделения хлороформного экстракта, испарения хлороформа до сухого остатка, растворения остатка в разбавленном растворе хлороводородной кислоты и измерения оптической плотности полученного раствора (Муравьева Г.М., Дмитриченко М.И. Судебно-химическое определение курантила и верапамила // Судебно-медицинская экспертиза. - 1995. - Т.38, N 1. - С.21-23).

Способ характеризуется недостаточно высокой степенью извлечения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина, относительно низкими точностью и чувствительностью определения.

Известен способ определения органических веществ основного характера, к которым относится, в частности, 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидин, в биологическом материале, заключающийся в измельчении биологического объекта, неоднократном настаивании с этанолом (каждый раз в течение суток), объединении вытяжек, сгущении объединенного извлечения, осаждении в нем белков абсолютным этанолом, фильтровании, упаривании фильтрата до густоты сиропа и разбавлении его водой с последующей экстракцией анализируемых соединений из щелочного раствора (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - C.119-123).

Способ характеризуется длительностью процесса определения, низкой степенью извлечения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина, недостаточно высокими чувствительностью и точностью.

Наиболее близким является способ определения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологическую пробу измельчают, трижды настаивают с этанолом (первый раз в течение 24 часов, второй и третий - в течение 1 часа), извлечения отделяют центрифугированием, отдельные центрифугаты объединяют, смешивают с разбавленным раствором хлороводородной кислоты, доводят рН среды полученной водно-этанольной смеси до 2,0, промывают эфиром, доводят рН среды до 9,0, экстрагируют хлороформом, хлороформное извлечение подкисляют раствором хлороводородной кислоты до рН 4,0-5,0, растворитель испаряют и определяют анализируемое вещество в остатке экстракционно-фотометрическим методом на основе реакции с метиловым оранжевым в сочетании с электрофорезом на бумаге с использованием в качестве электролита буферной смеси Бриттона-Робинсона с рН 2,0 (В.В.Зимнухов, Н.А.Бахарева, Е.Н.Травенко, А.В.Удалов. Смертельные отравления дипиридамолом // Судебно-медицинская экспертиза. - 1999. - Т.42, N3. - C.34).

Способ характеризуется значительными затратами времени на осуществление анализа, относительно низкой степенью извлечения анализируемого соединения, недостаточно высокой точностью и чувствительностью определения.

Задачей настоящего изобретения является снижение затрат времени на проведение анализа, повышение степени извлечения, а также точности и чувствительности определения.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань двукратно настаивают с ацетоном каждый раз в течение 30 минут, полученные извлечения объединяют, объединенное извлечение фильтруют, фильтрат испаряют до получения сухого остатка, остаток растворяют в хлороформе, экстрагируют 0,1 н. раствором хлороводородной кислоты, хлороформный слой отбрасывают, полученный кислотный экстракт промывают эфиром, эфирный слой отбрасывают, водный слой подщелачивают 10%-ным раствором гидроксида натрия до рН 8-10, насыщают хлоридом натрия, экстрагируют этилацетатом, полученный экстракт отделяют, обезвоживают, экстрагент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты, взятых в соотношении 8:2 (по объему), хроматографируют в колонке с сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 с использованием подвижной фазы ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют и измеряют оптическую плотность элюата при длине волны 286 нм.

Способ осуществляется следующим образом. Биологическую ткань, содержащую 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидин, двукратно настаивают с ацетоном каждый раз в течение 30 минут, полученные извлечения объединяют, объединенное извлечение фильтруют, фильтрат испаряют до получения сухого остатка, остаток растворяют в хлороформе, экстрагируют 0,1 н. раствором хлороводородной кислоты, хлороформный слой отбрасывают, полученный кислотный экстракт промывают эфиром, эфирный слой отбрасывают, водный слой подщелачивают 10%-ным раствором гидроксида натрия до рН 8-10, насыщают хлоридом натрия, экстрагируют этилацетатом, полученный экстракт отделяют, обезвоживают, экстрагент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты, взятых в соотношении 8:2 (по объему), хроматографируют в колонке с сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 с использованием подвижной фазы ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты (8:2), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют и измеряют оптическую плотность элюата при длине волны 286 нм.

Пример 1

Определение 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в ткани печени

К 25 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 50 мл ацетона и выдерживают 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют еще раз в указанных условиях. Отдельные извлечения объединяют, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 3 см с 10 г безводного сульфата натрия. Через слой сульфата натрия дополнительно пропускают 25 мл ацетона. Отдельные фильтраты объединяют в фарфоровой чашке, растворитель испаряют в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухого остатка. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа, экстрагируют дважды порциями 0,1 н. раствора хлороводородной кислоты по 20 мл каждая, полученные извлечения отделяют, объединяют, встряхивают в делительной воронке в течение 3 минут с 40 мл эфира, эфирный слой отбрасывают, в водный слой вводят 3,6 г хлорида натрия, полученный раствор подщелачивают 10%-ным раствором гидроксида натрия до рН 8-10 и экстрагируют дважды порциями этилацетата по 40 мл каждая. Экстракты отделяют, объединяют в фарфоровой чашке и испаряют в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты, взятых в соотношении 8:2 (по объему), и вводят полученный раствор в колонку размерами 490х11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» с размером частиц 30 . После полного вхождения раствора в сорбент осуществляют хроматографирование, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2). Элюат собирают фракциями по 1 мл каждая. Фракции элюата №№5-7, содержащие 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидин, объединяют в мерной колбе вместимостью 10 мл, и доводят содержимое колбы до метки смесью растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2). Оптическую плотность полученного раствора измеряют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 286 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидин определяют, используя уравнение калибровочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 10 мл вносят 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 мл 0,004% раствора 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в смеси растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2) и доводят содержимое каждой колбы до метки смесью растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2). Полученные растворы фотометрируют при длине волны 286 нм на спектрофотометре СФ-46 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности раствора от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

D=0,06814·С+0.00089,

где D - оптическая плотность; С - концентрация определяемого вещества в фотометрируемом растворе, мкг/мл.

Результаты определения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в крови

К 25 мл крови прибавляют 10 мг 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 50 мл ацетона и выдерживают 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют еще раз в указанных условиях. Отдельные извлечения объединяют, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 3 см с 10 г безводного сульфата натрия. Через слой сульфата натрия дополнительно пропускают 25 мл ацетона. Отдельные фильтраты объединяют в фарфоровой чашке, растворитель испаряют в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухого остатка. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа, экстрагируют дважды порциями 0,1 н. раствора хлороводородной кислоты по 20 мл каждая, полученные извлечения отделяют, объединяют, встряхивают в делительной воронке в течение 3 минут с 40 мл эфира, эфирный слой отбрасывают, в водный слой вводят 3,6 г хлорида натрия, полученный раствор подщелачивают 10%-ным раствором гидроксида натрия до рН 8-10 и экстрагируют дважды порциями этилацетата по 40 мл каждая. Экстракты отделяют, объединяют в фарфоровой чашке и испаряют в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты, взятых в соотношении 8:2 (по объему), и вводят полученный раствор в колонку размерами 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» с размером частиц 30 . После полного вхождения раствора в сорбент осуществляют хроматографирование, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2). Элюат собирают фракциями по 1 мл каждая. Фракции элюата №№5-7, содержащие 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидин, объединяют в мерной колбе вместимостью 10 мл и доводят содержимое колбы до метки смесью растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2). Оптическую плотность полученного раствора измеряют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 286 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина определяют, используя уравнение калибровочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологическую жидкость.

Построение калибровочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 10 мл вносят 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 мл 0,004% раствора 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в смеси растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2) и доводят содержимое каждой колбы до метки смесью растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2). Полученные растворы фотометрируют при длине волны 286 нм на спектрофотометре СФ-46 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности раствора от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

D=0,06814·С+0,00089,

где D - оптическая плотность; С - концентрация определяемого вещества в фотометрируемом растворе, мкг/мл.

Результаты определения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в крови представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 10 раз сокращает продолжительность одного определения (с 32 до 3-3,5 часов), в 1,3 раза увеличивает степень извлечения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина из биологического материала (с 70,56% до 94,65%), в три раза повышает точность определения (относительная ошибка среднего результата уменьшается с ±10,71% до ±3,58%), характеризуется более высокой чувствительностью (открываемый минимум снижается с 4,0 до 0,8 мг в 100 г биологической ткани).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.

Таблица 1
Результаты определения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в ткани печени (n=5; Р=0,95)
№	Внесено 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина, мг в 25 г ткани печени	Найдено		Метрологические характеристики
		мг	%
1.	10,00	9,735	97,35	=94,65
2.	10,00	9,285	92,85	S=2,73
3.	10,00	9,090	90,90	=1,22
4.	10,00	9,780	97,80	=3,39
5.	10,00	9,535	95,35	=3,58

Таблица 2
Результаты определения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-(1)пиримидина в крови (n=5; Р=0,95)
№	Внесено 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-фпиримидина, мг в 25 г крови	Найдено		Метрологические характеристики
		мг	%
1.	10,00	9,540	95,40	=97,94
2.	10,00	9,670	96,70	S=1,80
3.	10,00	9,890	98,90	=0,80
4.	10,00	9,950	99,50	=2,22
5.	10,00	9,920	99,20	=2,27

Таблица 3
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования ткани печени)
Показатели	Предлагаемый способ	Известный способ
1. Продолжительность одного определения	3-3,5 часа	Около 32 часов
2. Степень извлечения 2,6-бис-[бис-( -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина, в процентах от предварительно внесенного в биоматериал количества	94,65%	70,56%
3. Относительная ошибка среднего результата (n=5; Р=0,95) (при условии содержания 50 мг определяемого вещества в 100 г биоматериала)	3,58%	10,71%
4. Чувствительность (открываемый минимум), мг в 100 г биоматериала	0,8	4,0