способ определения витамина в6 в биологически активных добавках

Формула изобретения

Способ количественного определения витамина В6 в биологически активных добавках, включающий съемку вольтамперограмм с использованием трех электродной ячейки, состоящей из индикаторного платинового электрода, химически модифицированного фталоцианином Со(II), насыщенных хлорид - серебряных электродов сравнения и вспомогательного электрода в присутствии фонового электролита фосфатного буфера 0,025 М, рН 6,86, регистрацию анодных пиков проводят в дифференциально импульсном режиме съемки вольтамперограмм при линейной скорости развертки потенциала 50 мВ/с, концентрацию витамина В6 определяют по высоте пика тока электроокисления витамина В6 в интервале потенциалов от +0,85 до +0,95 В методом добавок аттестованных смесей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к вольтамперометрическому способу определения витамина В6 в пищевой и косметической промышленности. Изобретение может быть использовано при определении витамина В6 в экстрактах растительного сырья, продуктах питания и биологически активных добавках (БАДах), что, в свою очередь, позволяет определять наиболее сбалансированные по витаминам препараты и их дозировки, рекомендовать их к использованию в профилактических и лечебных целях.

Известен вольтамперометрический сенсор для определения витамина В6 при помощи графитового пастового электрода, модифицированного сален-комплексом ванадия (IV) (Marcos F.S. Teixeira, Glimaldo Marino, Edward R. Dockal, Eder T.G. Cavalheiro, "Voltametric determinashion of pyridoxine (vitamin B6) at a carbon paste electrode modified with vanady (IV) - Salen complex" // J. ANALYTICA СШМ1СА ACTA 508 (2004) 79-85, www.Elsevier.com/locate/acta). Модифицированный вольтамперометрический сенсор получают следующим образом: смешивают 0,15 г [VO(Salen)] с 0,6 г графитового порошка и добавляют 0,25 г минерального масла. Гомогенизируют смесь не мене 15 мин. Модифицированным графитом заполняют электрод, представляющий из себя пластиковую трубку, внутрь помещают контакт из нержавеющей стали. Рабочую поверхность зачищают на фильтровальной бумаге. После подготовки вольтамперометрического сенсора снимают циклические вольтамперограммы от -0,15 до +0,90 В, со скоростью развертки 25 мВ/с. В качестве фона используется 0,1 М раствор KCI, рН 5-9. Предел обнаружения витамина В6 данным образом составляет 3,7·10 ^-5 моль/л. Аналитическим сигналом витамина является анодный пик при потенциале 0.65 В.

Недостатком данной методики является наличие мешающих влияний при наличии в образце аскорбиновой кислоты (витамин С) и тиамина (витамина В1). Примесь аскорбиновой кислоты в растворе с концентрацией 5·10^-4 и 1·10^-3 моль/л уменьшает сигнал витамина В6 на 3,4% и 27% соответственно, такие же концентрации тиамина уменьшают ток на 11% и 29% соответственно. Наличие таких мешающих влияний не допускает применения данного метода при определении витамина В6 в БАДах, так как содержание в них витаминов В1 и С достаточно велико.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу являться метод совместного определения витаминов В1 и В6 на модифицированном фталоцианином кобальта угольно-пастовом электроде (Orlando Fatibello-Filho, Cleone D.С Conceicao, Auro A. Tanaka, «Simultaneous Diffeerential Pulse Voltametric Determination of Vitamins B1 (Thiamine) and В6 (Pyridoxine) in Pharmaceuticals Using a Carbon Paste Electrode Modified with Cobalt (II) Phthalocyanine», Poster Session PS2-136, Book of Abstracts, Euroanalysis XIII, European Conference on Analytical Chemistry, 5-10 September 2004. Salamanca, Spain, www.euroanalysis13.com "The Role of Analitycal Chemistry in the Protection of the Citizens"). Модифицированный электрод готовят следующим образом. Измельченный графитовый порошок 55% (от общей массы используемых компонентов) смешивают с фталоцианином Со(II) 20%, данную смесь гомогенизируют с помощью механического истирания в течение 30 мин. После того как смесь стала однородной, ее добавляют к разогретому до 60-65°С парафину 25% и доводят смесь до однородной пластичной субстанции. С помощью вакуумирования удаляют воздух и заправляют данной массой пластиковую трубку, в которую вставляется контакт.

Используя дифференциально импульсную вольтамперометрию и данный модифицированный пастовый электрод, получают аналитические сигналы от витамин В6 и тиамина (витамин В1) в следующих потенциалах 0,55 В и -0,13 соответственно при катодной развертке. В качестве фона используется фосфатный буфер, рН 7-13.

Минимальная определяемая концентрация пиридоксина этим методом практически равна 1.5·10^-5 моль/л. Линейная зависимость изменения тока от концентрации наблюдается в интервале концентраций 8,8·10 ^-5-7,4·10^-4 моль/л.

Недостатком метода является сложная схема приготовления модифицированного пастового электрода, в частности механическое измельчение и гомогенизация смеси и последующее вакуумирование, что невозможно без использования дополнительного оборудования. При воспроизведении метода вольтамперометрические характеристики электродов будут отличаться от партии к партии. Маленькая линейная область на калибровочном графике.

Задачей заявляемого изобретения является расширение возможности вольтамперометрического определения витаминов группы В, повышение экспрессности и селективности определения витамина В6 методом анодной дифференциальной вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что водорастворимый витамин В6 растворяют в фосфатном буфере с последующим вольтамперометрическим определением с помощью модифицированного электрода.

Обратимость электрохимических реакций и, следовательно, высокая чувствительность и воспроизводимость вольтамперометрических измерений во многом зависит от свойств индикаторного электрода. Поэтому материалу электрода, способам его регенерации, определяющим область потенциалов поляризации, величине аналитического отклика и возможности достижения заданных метрологических характеристик уделяется большое внимание.

Зачастую общеизвестные индикаторные электроды из ртути, углеродных материалов, а также золота, серебра платиновых металлов невозможно использовать. Электрохимические реакции на таких электродах зачастую протекают необратимо, осложнены адсорбцией и большим перенапряжением.

Поэтому в качестве индикаторного электрода применен платиновый электрод, модифицированный фталоцианином Со(II).

Схему обработки рабочей поверхности индикаторного электрода можно разложить на следующие стадии:

1. Обработка поверхности платинового электрода азотной кислотой для удаления всевозможных органических и неорганических загрязнителей.

2. Удаление азотной кислоты, промывание электрода дистиллированной водой, сушка поверхности.

3. Нанесение фталоцианина Со на платиновый электрод посредством сил адсорбции из насыщенного раствора данного металокомплекса, растворенного в серной кислоте.

4. Чтобы закрепить модификатор на подложке электрода, удаляется серная кислота посредством кратковременного погружения рабочей поверхности электрода в дистиллированную воду.

5. После этого электрод сушится до полного высыхания при комнатной температуре либо в термошкафу при температуре не более 100°С.

Методика определения заключается в съемке вольтамперограм окисления витамина В6 на химически модифицированном электроде. Важным при определении пиридоксина является использование дифференциального режима съемки вольтамперограмм. Существенным преимуществом такого вида съемки служит возможность получения высоких пиков, облегчающих расшифровку вольтамперограмм и уменьшающих ошибку измерения величины сигнала.

Использовался вольтамперометрический анализатор ТА-2 с подключенной к нему электрохимической ячейкой, состоящей из индикаторного химически модифицированного электрода, хлорид-серебряных электродов сравнения и вспомогательного электрода. Определение витамина В6 методом ДВА проводили с линейной скоростью развертки потенциала 50 мВ/с. Оптимальным фоном для определения витамина В6 является фосфатный буфер 0,025 М рН=6.86.

Получен аналитический сигнал витамина В6 при анодной развертке, потенциал окисления витамина равен 0,85 В. Измерения производились в присутствии других витаминов группы В, в тех же концентрациях, это существенно не изменило формы сигнала витамина В6. Таким образом, подобранные условия позволяют количественно определять витамин В6 с высокой чувствительностью на уровне 4,6·10^-4 моль/л. Линейная зависимость изменения тока от концентрации витамина В6 в растворе наблюдается в интервале концентраций 4,6·10 ^-4-4,32·10^-3 моль/л. См. чертеж.

Пример 1. Определение витамина В6 на уровне 10,0 мг/дм ³.

В стаканчик вместимостью 20 см ³ приливают 10 см³ 0,025 М раствора КН₂PO₄+NaHPO ₄ (фосфатного буфера). Регистрацию фоновой линии проводят в дифференциально-импульсном режиме съемки при линейной скорости развертки потенциала 50 мВ/с, в интервале потенциалов от +0.4-+1.4 В. Отсутствие пиков на вольтамперограмме свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,02 см³ аттестованного раствора витамина В6 концентрации 5000 мг/дм, перемешивают и проводят съемку вольтамперограммы, начиная с потенциала Е=+0,4 В. Анодный пик для указанной концентрации витамина регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,85 до 0,95 В. Затем в стаканчик с анализируемым раствором вносят добавку аттестованного раствора витамина В6 в том же объеме (V_доб=0,02 см³, С_доб=5000 мг/дм ³), перемешивают и регистрируют вольтамперограмму в тех же условиях. Концентрацию определяемого вещества оценивают по высоте пика методом добавок аттестованных смесей по общепринятой методике.

Пример 2. Определение витамина В6 в БАД "Пивные дрожжи" (форма выпуска - таблетки).

Навеску размельченных таблеток (Пивные дрожжи) массой 0,5 г, взятой с точностью до 0,01 г, переносят в стаканчик вместимостью 20 см ³, добавляют 10 см³ фосфатного буфера, перемешивают для лучшего растворения витамина В6 в фосфатном буфере. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. Из полученного фильтрата для вольтамперометрических измерений берут аликвоту пробы объемом 0,5 см³.

В стаканчик вместимостью 20 см³ приливают 9,5 см ³ 0,025 М раствора КН₂PO ₄+NaHPO₄ (фосфатного буфера). Фиксируют анодную вольтамперограмму в дифференциальном режиме при скорости развертки потенциала 50 мВ/с, начиная с потенциала Е=+0.4-+1.4 В. Отсутствие пиков на вольтамперограмме свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют аликвоту пробы, полученную вышеизложенным способом, перемешивают любым доступным образом и проводят съемку вольтамперограммы, начиная с потенциала Е=+0,4 В. Анодный пик для указанной концентрации витамина регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,85 до 0,95 В. Концентрацию определяемого вещества оценивают по высоте пика методом добавок аттестованных смесей по общепринятой методике. Время анализа одной пробы не превышает 15 мин.

Таким образом, дифференциальная вольтамперометрия с использованием химически модифицированного фталоцианином Со платинового электрода позволила существенно сократить пробаподготовку и длительность анализа. Дифференциальные вольтамперограммы хорошо воспроизводимы, условия съемки могут быть легко автоматизированы. Методика отличается простотой исполнения и может быть использована в любой лаборатории, имеющей полярограф, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественных вольтамперометрических компьютеризированных комплексов типа Та-2, СТА, ХАН, ВОЛАН.