фотобиокатализатор для образования водорода, способ его приготовления и фотохимический способ получения водорода

Формула изобретения

1. Фотобиокатализатор для образования водорода, включающий иммобилизованный фермент и твердый носитель, отличающийся тем, что в качестве иммобилизованного фермента он содержит гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль на 1 см² поверхности носителя, а носителем является наноструктуриванная мезопористая пленка диоксида титана, приготовленная из нанокристаллов диоксида титана размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.

2. Способ получения фотобиокатализатора по п.1 путем иммобилизации фермента на твердом носителе, которую осуществляют адсорбцией фермента на поверхности носителя в среде буферного раствора, отличающийся тем, что для иммобилизации используют фермент гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль на 1 см² поверхности носителя, которую адсорбируют на поверхности наноструктуриванной мезопористой пленки диоксида титана, приготовленной из нанокристаллов диоксида титана размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м ²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.

3. Фотохимический способ получения водорода, характеризующийся тем, что реакцию фотообразования водорода осуществляют в анаэробных условиях в присутствии фотобиокатализатора по п.1 и органического донора электрона при освещении УФ-светом с =365 нм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к фотобиокатализатору на основе фермента гидрогеназы, иммобилизованной на наноструктурированной мезопористой пленке диоксида титана (TiO₂ ) - фотоактивного полупроводника, и может быть использовано в энзиматических процессах получения водорода под действием света.

Водород является экологически чистым источником энергии. Разработка новых технологий получения водорода из воды имеет важнейшее значение.

Гидрогеназа - фермент, катализирующий реакцию:

2Н ⁺+2е^- Н₂.

Сложной проблемой является нестабильность изолированного фермента и ингибирование его активности кислородом. Повышение стабильности гидрогеназы, как и других ферментов, достигается иммобилизацией ферментов на различных носителях, при этом значительно повышается также технологичность их применения.

Известно большое количество иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов, включенных в полимерную матрицу различных гелей (RU 2233327, C12N 11/04, C12N 11/18, 27.07.2004; RU 2261911, C12N 11/02, C12S 9/00, C12S 13/00, 10.10.2005; RU 2210596, C12P 35/00, C12P 35/04, C07D 501/06, 20.08.2003) или адсорбированных на поверхности твердых пористых неорганических носителей: углеродных (RU 2279475, C12N 11/14, C12N 9/26, C12P 19/02, 10.07.2006; RU 2224020, C12N 11/14, C12N 9/26, C12P 19/02, 20.02.2004; RU 2167197, C12N 11/14, C12P 19/02, 20.05.2001) или минеральных (RU 2007456, C12N 11/14, A23K 1/165, 15.02.1994; RU 1473358, C12N 11/00, C12N 11/14, 20.02.2000).

Известные иммобилизованные биокатализаторы решают проблему повышения стабильности и технологичности применения использованных в них ферментов, но они не позволяют осуществлять фотохимические процессы.

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются биокатализатор на основе фермента глюкоамилазы, иммобилизованной на твердом гранулированном углеродном носителе, приготовленном из технической сажи и имеющем мезопористую структуру со средним диаметром пор 300-400 Å (30-40 нм) и объемом пор 0,7-0,9 см ³/г, и способ его приготовления путем адсорбции глюкоамилазы на поверхности указанного мезопористого углеродного носителя при температуре 20°С в течение 18 часов в среде 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,6) и последующей промывки буферным раствором (RU 2281328, C12N 11/14, C12N 9/26, С12Р 19/02, 10.08.2006 - прототип). Величина адсорбции глюкоамилазы составляет 8-13 мг белка на 1 г адсорбента.

Биокатализатор-прототип отличается более высокой активностью и стабильностью по сравнению с другими биокатализаторами на основе иммобилизованной глюкоамилазы, но не позволяет осуществлять фотохимические процессы. Способ приготовления биокатализатора, выбранный за прототип, не позволяет получать фотобиокатализаторы.

Задачей изобретения является создание фотобиокатализатора, способного с высокой скоростью продуцировать водород под действием света, на основе гидрогеназы, иммобилизованной на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂, а также разработка способа его приготовления, позволяющего получать высокоактивный и стабильный фотобиокатализатор. Задачей изобретения является также разработка эффективного фотохимического способа получения водорода с помощью предлагаемого фотобиокатализатора.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым фотобиокатализатором для образования водорода, включающим иммобилизованный фермент и твердый носитель, который в качестве иммобилизованного фермента содержит гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль (0,068-0,156 мг) на 1 см² поверхности носителя, а носителем является нано-структуриванная мезопористая пленка TiO ₂, приготовленная из нанокристаллов TiO ₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.

Решение поставленной задачи достигается также предлагаемым способом получения фотобиокатализатора для образования водорода путем иммобилизации фермента на твердом носителе, которую осуществляют адсорбцией фермента на поверхности носителя в среде буферного раствора. Для иммобилизации используют фермент гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль (0,068-0,156 мг) на 1 см² поверхности носителя, которую адсорбируют на поверхности наноструктурированной мезопористой пленки TiO₂, приготовленной из нанокристаллов TiO₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.

Решение поставленной задачи достигается также предлагаемым фотохимическим способом получения водорода, характеризующимся тем, что реакцию фотообразования водорода осуществляют в анаэробных условиях в присутствии описанного выше заявляемого фотобиокатализатора и органического донора электронов при освещении УФ-светом с =365 нм.

Известно, что неорганические полупроводники, например TiO₂ являются катализаторами фотохимических реакций (RU 2275238, B01J 21/06, C01G 23/053, 27.04.2006; 10.09.2005; US 6939611, B32B 9/00, B01J 23/00, 06.09.2005; US 6387844, B01J 23/00, B01J 21/08, B01J 21/12, B32B 17/06, B32B 19/00,14.05.2002).

Широкое исследование окислительно-восстановительных реакций, фотосенсибилизированных неорганическими полупроводниками в биохимических системах, привело к развитию нового направления в катализе - фотобиокатализа, изучающего сопряженное действие неорганических полупроводников и ферментов (В.В.Никандров "Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность". Успехи биологической химии, 2000, т.40, с.357-396). Первая работа, в которой была реализована окислительно-восстановительная фотореакция при сопряженном действии неорганических полупроводников и ферментов, опубликована в 1976 г. (Красновский А.А., Брин Г.П., Никандров В.В. // Докл. АН СССР, 1976, т.229, с.990-993), в которой было осуществлено фотовыделение водорода из водных суспензий микрочастиц полупроводников (TiO₂, ZnO), содержащих гидрогеназу, освещаемых ближним УФ-светом ( =365 нм). Дальнейшие исследования показали, что в случае применения в качестве полупроводника-фотосенсибилизатора сульфида кадмия (CdS), фотообразование водорода протекает на видимом свету (Красновский А.А. и др., // Докл. АН СССР, 1979, т.249, с.896-899; Cuender P. et al. // Photobiochem. Photobiophys. 1984, v.7, p.331-340; Никандров В.В. и др. // Докл. АН СССР, 1994, т.335, с.802-805).

В настоящее время, в связи с развитием нанобиотехнологии, основное внимание исследователей обращено к наноструктурированным полупроводниковым носителям для иммобилизации ферментов. Известно использование комплексов полупроводниковых наночастиц CdS с ферментом ацетилхолинэстеразой в качестве фотокаталитического элемента биосенсора нервнопаралитических газов (Hoffmann M.R. et al., Chem. Rev., 1995, v.95, №1, p.69-96).

Предлагаемые фотобиокатализатор, способ его приготовления и фотохимический способ получения водорода были разработаны в результате проведенных авторами исследований влияния на процесс адсорбции белков структуры мезопористых нано-структурированных пленок TiO₂ и условий иммобилизации на них гидрогеназы и изучения механизма сопряженного действия полупроводника и фермента в фотобиокатализаторе.

Способ получения мезопористых наноструктурированных пленок Ti02 и иммобилизация на них различных ферментов являются предметом отдельной заявки, поданной одновременно с данной.

При исследовании адсорбционных свойств пленок TiO₂ наряду с гидрогеназой использовали бычий сывороточный альбумин (БСА), не обладающий ферментативной активностью, но имеющий молекулярный вес, размер и изоэлектрическую точку (ИЭТ), близкие аналогичным характеристикам фермента гидрогеназы (см. таблицу 1). Используемая в настоящей работе гидрогеназа была выделена из фототрофной бактерии Thiocapsa roseopersicina, штамм BBS.

Таблица 1.
Свойства белков, используемых для оценки сорбционной способности мезопористых наноструктурированных пленок TiO 2.
Белок	Молекулярная масса, Да	ИЭТ
БСА	66338	4,8
Гидрогеназа	68000	4,2

Сорбция белков на пленках осуществлялась выдерживанием пленок (плошадь пленки 1-4 см², толщина 5-10 мкм) в 3 мл водного буферного раствора белка при температуре 4°С в течение 1-12 суток. Стандартные условия: 0,05 М ТРИС буфер, рН 7,2; концентрация белка 0,1-5·10^-5 М белка. Была исследована зависимость сорбции от удельной поверхности и размера наночастиц TiO₂, использованных для получения пленок.

Оценка сорбционной способности пленок TiO₂ осуществлялась спектрофотометрически по убыли оптической плотности (D) раствора белка, инкубированного с пленкой. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000.

Полученные результаты позволили установить, что наилучшими сорбционными свойствами обладают пленки толщиной 10 мкм, полученные из нанокристаллов TiO₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г.

При выборе оптимальных условий приготовления заявляемого фотобиокатализатора исследовалась кинетика сорбции (на примере БСА) в зависимости от концентрации белка в растворе, от состава и рН среды. Полученные результаты представлены в таблицах 2, 3 и на фиг.1.

Как видно из приведенных данных, оптимальной концентрацией белка при его иммобилизации на пленках TiO₂ является 0,5-5·10^-5 М при значении рН буферного раствора 5,5-8,0. В присутствии хлорида кальция сорбция идет быстрее.

Сорбция гидрогеназы проводилась в тех же условиях, что и сорбция альбумина. Измерения проводили в течение 8 дней. Как и в случае с альбумином, в данных экспериментах сорбция достигла определенного значения за первые 2 суток, а потом увеличивалась лишь на несколько процентов за 6 дней. Удельная сорбция пленок для гидрогеназы варьировалась от 0,1 нмоль/см ² до 2,3 нмоль/см² в зависимости от типа пленки и условий сорбции (см. примеры ниже).

Таблица 2.
Влияние концентрации БСА в растворе на эффективность сорбции белка*.
Концентрация БСА, М	Сорбция БСА, нмоль/см2
5·10-5	3,18
2·10 -5	2,53
10-5	1,00
5·10-6	1,15
2·10-6	0,93
*Пленки выдерживались в 3 мл раствора БСА в трис-буфере (0,05М, рН 7,2)

Таблица 3.
Влияние рН буферного раствора на сорбцию БСА.
рН	буфер	сорбция, нмоль/см 2
5,5	MES + трис	2,35
6,02	MES + трис	1,47
8,05	трис	1,03
9,1	трис	0,25

Активность гидрогеназы, иммобилизованной на пленках TiO₂ , определяли газохроматографически в 0,05 М трис-буфере при рН 7,2 по скорости образования водорода в присутствии 2,5 ммоль восстановленного метилвиологена (MV) в реакции:

В качестве восстановителя для метилвиологена использовали дитионит натрия (10 мг/мл). Реакцию проводили в анаэробных условиях в стеклянном флаконе объемом 11 мл в 5 мл раствора при 23°С при перемешивании.

Скорость образования водорода, катализируемого гидрогеназой, иммобилизованной на пленке TiO₂ , в темновой реакции при окислении восстановленного метилвиологена пропорциональна количеству фермента (см. фиг.2). Активность фермента при иммобилизации на пленке падает в 2,5-3 раза.

Фотообразование водорода пленками TiO₂, содержащими гидрогеназу, исследовали, используя в качестве доноров электронов дитиотреитол и трис-(оксиэтил)-аминометан - органические соединения, которые не способны выступать в качестве субстратов для гидрогеназы и не способны приводить к фотообразованию водорода на пленках TiO ₂ в отсутствие фермента. Пример фотообразования водорода, катализируемого нано-структурированными мезопористыми пленками TiO₂, содержащими гидрогеназу, в присутствии 0,1 М дитиотреитола представлен на фиг.3. Было проведено сопоставление скоростей реакции и активности гидрогеназы при образовании водорода на пленках TiO₂, содержащих гидрогеназу, в темновой реакции при окислении восстановленного метилвиологена и в световой реакции при фотоокислении дитиотреитола. Результаты анализа представлены в таблице 4.

Таблица 4.
Сравнение образования водорода пленками TiO2 , содержащими гидрогеназу, в темновой реакции при окислении восстановленного метилвиологена и в световой реакции при фотоокислении дитиотреитола.
	Образование водорода в темновой реакции при окислении восстановленного метилвиологена (подложка для пленки - обычное стекло)	Фотообразование водорода (подложка для пленки - обычное стекло)	Фотообразование водорода (подложка для пленки - стекло с токопроводящим покрытием)
Площадь пленки, см 2	2,2	2,07	1
Общее количество фермента на пленке, нмоль	5	2,1	1,08
Плотность фермента на пленке, мг/см2	0,155	0,069	0,073
Общая скорость образования водорода в пробе, мкл/мин	5,63	1,13	0,78
Удельная ферментативная активность образования водорода, мкл/мг·мин	16,6	7,9	10,7
Скорость образования водорода с 1 см2 пленки с нормировкой на количество фермента мкл/мг·мин·см2	7,54	3,81	10,7

Анализ результатов показывает:

1) Эффективность световой реакции сопоставима с эффективностью темновой, где в качестве донора электрона выступает восстановленный метилвиологен. Таким образом, электрон, фотогенерированный наночастицами полупроводника в пленке, используется ферментом в качестве субстрата для восстановления протона не менее эффективно, чем восстановленный метилвиологен, обладающий окислительно-восстановительным потенциалом, близким потенциалу водородного электрода.

2) Величины удельной активности гидрогеназы во всех исследуемых системах близки. Этот факт указывает на насыщение фермента по субстрату - восстановленному метивиологену или фотогенерированному электрону. Для получения больших скоростей фотообразования водорода необходимо увеличить сорбционную емкость пленки или увеличить ее площадь.

В целом процесс фотообразования водорода на предлагаемом фотобиокатализаторе можно представить следующим образом (см. фиг.4): в результате связывания фермента гидрогеназы с поверхностью пленки TiO ₂ происходит формирование наноразмерного фотобиокатализатора, представляющего собой комплекс фермента с несколькими нанокристаллами неорганического полупроводника. При световом возбуждении в наночастицах полупроводника происходит разделение зарядов с последующим восстановлением реакционного центра фермента фотогенерированными электронами. Фермент использует электроны для образования молекулярного водорода. Фотогенерированная в полупроводнике дырка мигрирует от наночастиц в составе комплекса к поверхности наноструктурированной пленки, где происходит окисление донора электронов.

Приводим примеры осуществления изобретения.

А. Получение фотобиокатализатора образования водорода.

Пример 1.

Наноструктуриванную мезопористую пленку TiO₂ получали из промышленного порошка нанокристаллов со средним размером 15 нм с удельной поверхностью 100 м²/г (ТКР 102, фирма Tayka, Япония): 2 г порошка смешивают с 0,3 мл 0,1 М раствора азотной кислоты и подвергают дезагрегированию в ультразвуковом диспергаторе мощностью 300 Вт в течение 15 мин. Полученная однородная масса разбавляется 2 мл 0,1% раствора Тритон Х100. Добавляется 0,2 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 и осуществляется гомогенизация ультразвуком (600 Вт) в течение 15 минут. Полученная паста равномерно наносится на подложку с использованием прокладки для получения пленки заданной толщины (10 мкм) и высушивается при комнатной температуре. Затем органические вещества выжигаются в течение 30 мин при 450°С в токе воздуха.

Иммобилизацию гидрогеназы на полученной пленке TiO₂ (подложка из обычного стекла, толщина пленки 10 мкм, площадь пленки 1,6 см² ) осуществляли адсорбцией в среде буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН=7,2) при концентрации гидрогеназы 5,5·10 ^-6 М при температуре 4°С в течение 8 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 0,156 нмоль/см ² пленки (0,011 мг/см²).

Пример 2.

Иммобилизацию гидрогеназы осуществляли на пленке TiO ₂, полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов, со средним размером 15 нм с удельной поверхностью 100 м ²/г (ТКР 102) с использованием 0,05 М уксусной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 2,07 см ² (подложка из обычного стекла, толщина пленки 10 мкм) при концентрации гидрогеназы 5,5·10^-6 М в среде буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН=7,2) при температуре 4°С в течение 2 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 0,135 нмоль/см² пленки (0,008 мг/см²).

Пример 3.

Иммобилизацию гидрогеназы осуществляли на пленке TiO₂ , полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов со средним размером 25 нм с удельной поверхностью 50 м ²/г (Aeroxide P25) с использованием 0,1 М азотной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 2,2 см ² (подложка из обычного стекла) при концентрации гидрогеназы 5,5·10^-6 М в среде буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН 8,0) при температуре 4°С в течение 5 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 1,05 нмоль/см² пленки (0,071 мг/см ²).

Пример 4.

Иммобилизацию гидрогеназы осуществляли на пленке TiO₂, полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов со средним размером 25 нм с удельной поверхностью 50 м²/г (Aeroxide P25) с использованием 0,1 М азотной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 2,2 см² (подложка из стекла с токопроводящим покрытием) при концентрации гидрогеназы 5,5·10 ^-5 М в среде буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН 8,0) при температуре 4°С в течение 5 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 1,08 нмоль/см ² пленки (0,073 мг/см²).

Пример 5.

Иммобилизацию гидрогеназы осуществляли на пленке TiO ₂, полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов со средним размером 25 нм с удельной поверхностью 50 м ²/г (Aeroxide P25) с использованием 0,75 М азотной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 2,2 см ² (подложка из обычного стекла) при концентрации гидрогеназы 0,55·10^-5 М в среде буферного раствора (ТРИС буфер 0,05 М, рН 8,0) при температуре 4°С в течение 5 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков гидрогеназы. Величина адсорбции гидрогеназы составила 2,3 нмоль/см² пленки (0,156 мг/см ²).

Б. Реакция фотообразования водорода.

Фотохимические эксперименты проводили в стеклянных флаконах (объем 11 мл), закрытых резиновыми крышками и затянутых металлическими фиксаторами.

Во флакон помещалось стекло с нанесенной на него пленкой. Перед опытами флаконы с образцами продували инертным газом для удаления кислорода. Добавление растворов донора электронов: дитиотреитола (0,1 М) или трис-(оксиэтил)-аминометана (0,2 М), также освобожденных от кислорода, в ячейку осуществляли введением шприцем через резиновую пробку. Освещение образцов проводилось лампой ДРШ-250 (мощность 250 Вт, интенсивность света 4·10⁵ эрг/см²·сек, фильтрами УФС-6 и СЗС-22 выделялась полоса 365 нм) при постоянном перемешивании.

При определении состава газовой фазы пробу отбирали шприцем и вносили на колонку газового хроматографа Chrom-4 (Чехословакия). В качестве газа-носителя использовали аргон, в качестве наполнителя колонок - молекулярные сита.

Примеры получения водорода на предлагаемом фотобиокатализаторе при освещении ближним УФ-светом водных буферных растворов, содержащих 0,1 М дитиотреитол, приведены в таблице 4 и на фиг.3 (использовались фотобиокатализаторы, полученные по примерам 4 и 5).

При получении водорода на фотобиокатализаторе, полученном по примеру 3, в присутствии в качестве донора электронов 0,2 М раствора трис-(оксиэтил)-аминометана наблюдаемая удельная фотокаталитическая активность 1 см² пленки составила 1,57 мкл H₂/мин·мг гидрогеназы.

Таким образом, предложен фотобиокатализатор на основе гидрогеназы, иммобилизованной на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂, позволяющий с достаточно высокой скоростью получать водород под действием света, разработаны способ приготовления катализатора и энзиматический способ получения водорода под действием света, отвечающий самым высоким требованиям экологической безопасности. Предложенный катализатор может использоваться в различных устройствах для получения водорода из воды, а также в топливных элементах.