способ дезинфекции объектов окружающей среды

Формула изобретения

Способ дезинфекции объектов окружающей среды путем обработки пероксидом водорода, отличающийся тем, что объекты предварительно обрабатывают раствором соли двухвалентного железа в концентрации равной 5-15 мМ, а затем с интервалом 5-10 мин раствором пероксида водорода в концентрации 20-50 мМ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии, и может быть использовано для дезинфекции объектов окружающей среды, контамированных микроорганизмами.

В настоящее время большое распространение получили способы дезинфекции с применением дезинфицирующих средств, состоящих из соединений различных классов. Известны способы дезинфекции с использованием различных дезинфицирующих препаратов: спиртов, альдегидов, кислот, щелочей, галогенсодержащих соединений (Венцел Р.П. Внутрибольничные инфекции. М.: Медицина, 1990, с.171-187).

Так, например, из класса четвертичных аммониевых соединений, используемых в качестве дезинфицирующих средств, наиболее известны: алкилдиметилбензиламмонийхлорид и цетилпиридинийхлорид, которые используются как в качестве самостоятельных дезинфицирующих средств (А.Шварц и др. "Поверхностно-активные вещества и моющие средства", изд. Иностранной литературы, М., 1960, с.152), так и в составе дезинфицирующих композиций (патенты РФ №2146151, А61L 2/16, опубл. 10.03.2000 и №2118174, А61L 2/16, опубл. 27.08.1998).

Известно, что длительное применение различных дезинфицирующих средств приводит к адаптации к ним микроорганизмов и, соответственно, к неэффективности дезинфекционных мероприятий (Соколова Н.Ф. Методологические основы определения устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам. Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 2002, 4, с.55-56).

Известна устойчивость грамотрицательных бактерий к ряду поверхностно-активных веществ катионной и анионной природы (Kramer V.C., Nickerson K.W., Hamlet O.V., О, Hara С. Prevalence of extreme detergent resistance among the Enterobacteriaceae. // Can. J.Microbiol., 1984, vol.30, №5, p.711-713).

Существенным недостатком всех существующих дезинфицирующих веществ является их устойчивость к разложению и кумуляция в биологических объектах окружающей среды, что представляет собой опасность с точки зрения охраны окружающей среды.

Наиболее близкими к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков являются способы дезинфекции объектов, контамированных микроорганизмами, растворами пероксида водорода (Красильников А.П. Справочник по антисептике. - Мн.: Выш. шк. - 1995. - 367 с.).

Однако указанные способы имеют ряд существенных недостатков.

В известных способах для дезинфекции применяются высокие концентрации (3% и 6%) раствора пероксида водорода, обладающие выраженным коррозийным действием на дезинфицируемые объекты.

Для реализации указанных способов необходимо длительное время обработки дезинфицируемых объектов. Известна устойчивость микроорганизмов к дезинфицирующим веществам из классов окислителей, что объясняется продукцией микроорганизмами широкого спектра антиокислительных ферментов и веществ (Menendez M.C., Ainsa J.A., Martin С., Garcia M.J. katGI and katGII encode two different catalases-peroxidases in Mycobacterium fbrtuitum. // J.Bacteriol. 1997., Vol.179. (22). P.6880-6886, Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н., Октябрьский О.Н. Перекись водорода модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escherichia coli // Микробиология. 1998. Т.67. №5. С.594-600).

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в создании экологически безопасного способа дезинфекции объектов окружающей среды, обладающего широким спектром действия по отношению к различным группам микроорганизмов при использовании низких концентраций дезинфектанта и сокращении времени дезинфекции

Для достижения указанного технического результата в предлагаемом способе дезинфекции объектов окружающей среды объекты предварительно обрабатывают раствором соли двухвалентного железа в концентрации, равной 5 мМ и более, а затем раствором пероксида водорода в концентрации, равной 20 мМ и более.

Отличительными признаками предложенного способа являются предварительная обработка дезинфицируемых объектов раствором соли двухвалентного железа в концентрации, равной 5 мМ и более, а затем раствором пероксида водорода в концентрации, равной 20 мМ и более.

Авторами экспериментально выявлен эффект выраженного потенцирования бактерицидного действия пероксида водорода добавлением раствора солей двухвалентного железа при использовании этих веществ в малых концентрациях.

При изучении влияния на выживание микроорганизмов различных концентраций пероксида водорода авторами было обнаружено усиление его действия после предварительной обработки микроорганизмов растворами солей двухвалентного железа. Выявленное авторами выраженное антибактериальное действие связано с генерацией гидроксильных радикалов, образующихся в результате взаимодействия ионов двухвалентного железа с пероксидом водорода (Ryan T.P., Aust S.D. The role of iron in oxygen-mediated toxicities. // Grit. Rev. Toxicol. - 1992. - Vol.22. P.119-141) и обладающим мощным бактерицидным эффектом (Alam, M.Z. and Ohgaki, S. Role of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in producing the residual effect of ultraviolet radiation. // Water Environ Res. - 2002. - v.74. - P.248-255).

На первом этапе работы использовался эпидемиологически значимый при внутригоспитальных инфекциях микроорганизм Staphylococcus aureus. Оценивали бактерицидное действие следующим способом. Приготовляли взвесь микроорганизмов (способ приготовления взвесей: 24-часовую агаровую культуру микроорганизмов смывали стерильным 0,9% раствором хлорида натрия и готовили микробные взвеси, оптическая плотность которых соответствовала 0,27 при 591 нм на СФ-46). К 0,2 мл полученных микробных взвесей добавляли по 0,2 мл раствора FeSO₄ в концентрациях от 0 до 15 мМ с интервалом в 1 мМ, инкубировали в течение 5 минут комнатной температуре. Затем к 0,4 мл полученных микробных смесей добавляли по 0,4 мл раствора пероксида водорода в концентрациях от 5 до 600 мМ с интервалом в 5 мМ, инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Из инкубированных смесей делали высевы на 1,5% мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», Махачкала).

Результаты исследований представлены в табл.1, отражающей выживаемость культуры Staphylococcus aureus в зависимости от концентрации FeSO₄ и пероксида водорода.

Как видно из данных, представленных в табл.1, бактерицидный эффект достигается при использовании концентраций FeSO ₄ и пероксида водорода соответственно 5-15 мМ и 20-50 мМ, в то время как при раздельном использовании компонентов тех же концентраций такого эффекта не наблюдается.

На следующем этапе исследования для оценки спектра действия заявляемого способа дезинфекции использовались эпидемиологически значимые при внутригоспитальных инфекциях микроорганизмы: Staphylococcus aureus и Escherichia coli, в качестве спорообразующих микроорганизмов был использован штамм Bacillus subtilis ATCC 6633. Оценивали бактерицидное действие следующим способом. Приготовляли взвесь микроорганизмов (способ приготовления взвесей: 24-часовую агаровую культуру микроорганизмов смывали стерильным 0,9% раствором хлорида натрия и готовили микробные взвеси, оптическая плотность которых соответствовала 0,27 при 591 нм на СФ-46). К 0,2 мл полученных микробных взвесей добавляли по 0,2 мл раствора соли железа (II) (FeSO₄ , FeCl₂) в концентрациях от 0 до 15 мМ с интервалом в 1 мМ, инкубировали в течение 5-10 минут при комнатной температуре. Затем к 0,4 мл полученных микробных смесей добавляли по 0,4 мл раствора пероксида водорода в концентрациях от 5 до 60 мМ с интервалом в 5 мМ, инкубировали в течение 15-20 минут при комнатной температуре. Из инкубированных смесей делали высевы на 1,5% мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», Махачкала).

Результаты исследований представлены в табл.2, 3 и 4, отражающих выживаемость культур Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Bacillus subtilis в зависимости от концентрации солей двухвалентного железа и пероксида водорода. Как видно из данных, представленных в табл.2, 3 и 4, выживаемость микроорганизмов, в том числе и спорообразующих, при совместном использовании растворов солей железа (II) и пероксида водорода значительно ниже, чем при их раздельном применении в тех же концентрациях. Так, например, при обработке культуры Staphylococcus aureus раствором пероксида водорода в концентрациях от 0 до 60 мМ выживало около 85% микроорганизмов, тогда как при совместной обработке культуры 5 мМ раствором FeCl ₂ и 20 мМ раствором пероксида водорода наблюдалось полное уничтожение микроорганизмов (табл.2). При обработке культуры Escherichia coli раствором пероксида водорода в концентрациях от 0 до 60 мМ полная гибель микроорганизмов наблюдалась только при использовании пероксида водорода в концентрации выше 40 мМ, однако при совместной обработке культуры 5 мМ раствором FeCl ₂ и 20 мМ раствором пероксида водорода наступала полная гибель микроорганизмов (табл.3). Аналогичные результаты авторами получены и при обработке культуры Bacillus subtilis: установлено, что при обработке микроорганизмов раствором пероксида водорода в концентрациях от 0 до 60 мМ не наблюдалось полного уничтожения микроорганизмов, тогда как при совместной обработке культуры 5 мМ раствором FeCl₂ и 20 мМ раствором пероксида водорода наступала их полная гибель (табл.4). Таким образом, на основании проведенных исследований авторами установлено, что при последовательной обработке микроорганизмов растворами солей железа в концентрации 5 мМ и выше и раствором пероксида водорода в концентрации 20 мМ и выше наблюдалось полное уничтожение микроорганизмов.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Приготовляются раствор соли железа (II) (FeSO ₄, FeCl₂ и др.) в концентрации 5 мМ и более и раствор пероксида водорода в концентрации 20 мМ и более.

2. Поверхность объекта обрабатывается приготовленным раствором соли железа (II) при помощи распылителя из расчета 500 мл/м³ или помещением объекта в емкость, содержащую приготовленный раствор соли железа (II). Для дезинфекции биологических жидкостей в последние добавляют соли железа (II) (FeSO₄, FeCl₂ и др.) до конечной концентрации 5 мМ и более.

3. Затем поверхность объекта обрабатывается приготовленным раствором пероксида водорода при помощи распылителя из расчета 500 мл/м³ или помещением объекта в емкость, содержащую приготовленный раствор пероксида водорода. Для дезинфекции биологических жидкостей в последние добавляют пероксид водорода до конечной концентрации 20 мМ и более

и, при необходимости, проводят стандартными методами оценку степени микробной обсемененности поверхности или объекта.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Поверхность окрашенной стены при помощи распылителя обрабатывали 15 мМ раствором сульфата железа (II) из расчета 500 мл/м³, затем 50 мМ раствором пероксида водорода из расчета 500 мл/м³. Через 20 минут методом отпечатков на агаре определяли количество выживших бактерий и микроскопических грибов и сравнивали с количеством микроорганизмов на необработанной поверхности стены.

Выявили, что количество микроорганизмов на необработанной и обработанной части оштукатуренной стены составило соответственно 760 и 3 КОЕ/см ².

Таким образом, выявлено, что предлагаемая в способе последовательная обработка поверхности оштукатуренной стены 15 мМ раствором сульфата железа (II) и затем 50 мМ раствором пероксида водорода приводит к снижению микробной обсемененности примерно в 250 раз.

Пример 2. В емкость, содержащую жидкие отходы пищевого производства, добавляли хлорид железа (II) до конечной концентрации 10 мМ. После перемешивания в течение 2-3 минут в емкость добавляли пероксид водорода до конечной концентрации 30 мМ.

Методом серийных разведений определяли количество выживших микроорганизмов, число которых составило до и после обработки соответственно 639 и 0 КОЕ/мл. Таким образом, использование заявляемого способа дезинфекции привело к полному уничтожению бактерий в обрабатываемом материале.

Пример 3. Медицинские инструменты - пинцет, корнцанг и скальпель - помещали в емкость, содержащую раствор хлорида железа (II) в концентрации 15 мМ, затем в емкость с раствором пероксида водорода в концентрации 30 мМ. Проведенное контрольное бактериологическое исследование смывов обработанных заявляемым способом медицинских инструментов не выявило наличия микроорганизмов.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет дезинфицировать объекты окружающей среды: изделия и объекты медицинского, хозяйственного и бытового назначения, а также большие объемы жидкостей медицинского и коммунального происхождения, снижая количество жизнеспособных форм микроорганизмов.

Таблица 1
Выживаемость культуры Staphylococcus aureus в зависимости от концентраций FeSO4 и пероксида водорода
	концентрация FeSO4, мМ
	0 мМ		1 мМ		5 мМ		10 мМ		15 мМ
концентрация H 2O2, мМ	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля
0	2525	100	2525	100	2525	100	2525	100	2518	100
5	2434	96,4	1800	71,3	56	2,2	44	1,7	35	1,4
10	2410	95,5	1630	64,6	35	1,4	27	1,1	12	0,5
15	2390	95	1120	44,4	14	0,6	0	0	0	0
20	2352	93,2	837	33,1	0	0	0	0	0	0
25	2295	90,8	496	19,6	0	0	0	0	0	0
30	2246	88,9	158	6,3	0	0	0	0	0	0
35	2180	86,3	68	2,7	0	0	0	0	0	0
40	2172	86	35	1,4	0	0	0	0	0	0
50	2148	85,1	0	0	0	0	0	0	0	0
60	2124	84,1	0	0	0	0	0	0	0	0
70	2028	80,3	0	0	0	0	0	0	0	0
80	1932	76,5	0	0	0	0	0	0	0	0
90	1836	72,7	0	0	0	0	0	0	0	0
100	1548	61,3	0	0	0	0	0	0	0	0
150	1260	49,9	0	0	0	0	0	0	0	0
200	972	38,5	0	0	0	0	0	0	0	0
250	684	27,1	0	0	0	0	0	0	0	0
300	514	20,4	0	0	0	0	0	0	0	0
350	432	17,1	0	0	0	0	0	0	0	0
400	407	16,1	0	0	0	0	0	0	0	0
450	382	15,1	0	0	0	0	0	0	0	0
500	357	14,1	0	0	0	0	0	0	0	0
550	332	13,1	0	0	0	0	0	0	0	0
600	307	12,2	0	0	0	0	0	0	0	0

Таблица 2
Выживаемость культуры Staphylococcus aureus в зависимости от концентраций FeCl2 и пероксида водорода
	концентрация FeCl2, мМ
	0 мМ		1 мМ		5 мМ		10 мМ		15 мМ
концентрация H 2O2, мМ	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля
0	2525	100	2525	100	2525	100	2525	100	2518	100
5	2207	87,4	1800	71,3	56	2,2	44	1,7	35	1,4
10	2201	87,2	1630	64,6	35	1,4	27	1,1	12	0,5
15	2207	87,4	1120	44,4	14	0,6	0	0	0	0
20	2200	87,1	837	33,1	0	0	0	0	0	0
25	2196	87	496	19,6	0	0	0	0	0	0
30	2188	86,7	158	6,3	0	0	0	0	0	0
35	2180	86,3	68	2,7	0	0	0	0	0	0
40	2172	86	35	1,4	0	0	0	0	0	0
50	2148	85,1	0	0	0	0	0	0	0	0
60	2124	84,1	0	0	0	0	0	0	0	0

Таблица 3
Выживаемость культуры Escherichia coli в зависимости от концентраций FeSO4 и пероксида водорода
	концентрация FeSO4, мМ
	0 мМ		1 мМ		5 мМ		10 мМ		15 мМ
концентрация H 2O2, мМ	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля
0	2623	100	2623	100	2356	100	2001	100	1985	100
5	2203	84,0	1986	75,7	569	24,2	38	1,9	12	0,6
10	1783	68,0	1635	62,3	218	9,3	25	1,2	4	0,2
15	1363	52,0	982	37,4	133	5,6	4	0,2	0	0
20	943	36,0	602	23,0	0	0	0	0	0	0
25	523	19,9	40	1,5	0	0	0	0	0	0
30	115	4,4	0	0	0	0	0	0	0	0
35	38	1,4	0	0	0	0	0	0	0	0
40	43	1,6	0	0	0	0	0	0	0	0
50	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
60	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

Таблица 4
Выживаемость культуры Bacillus subtilis в зависимости от концентраций FeSO4 и пероксида водорода
	концентрация FeSO4, мМ
	0 мМ		1 мМ		5 мМ		10 мМ		15 мМ
концентрация H 2O2, мМ	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля	КОЕ	% от контроля
0	1794	100	1794	100	1794	100	1702	100	1680	100
5	1710	95,3	1630	90,9	569	31,7	68	4	22	1,3
10	1680	93,6	1486	82,8	218	12,2	37	2,2	14	0,8
15	1452	80,9	1102	61,4	87	3,7	24	1,4	4	0,2
20	1160	64,7	718	40,0	0	0	0	0	0	0
25	760	42,4	334	18,6	0	0	0	0	0	0
30	470	26,2	234	13,0	0	0	0	0	0	0
35	270	15,1	135	7,5	0	0	0	0	0	0
40	150	8,4	68	3,8	0	0	0	0	0	0
50	90	5	39	2,2	0	0	0	0	0	0
60	8	0,4	0	0,0	0	0	0	0	0	0