штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца вирог-43м для вакцинации растений огурца

Формула изобретения

Штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца ВИРОГ-43М для вакцинации растений огурца.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики и представляет собой бессимптомный штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), который можно использовать для защиты растений огурца путем вакцинации растений.

Метод вакцинации растений давно разработан и успешно применяется в сельском хозяйстве. Эффект вакцинации слабопатогенным (ослабленным) штаммом заключается в том, что размножение такого предварительно введенного штамма вируса служит препятствием для размножения родственного патогенного вируса. При введении в растение слабопатогенного штамма вируса эти растения приобретают "иммунитет" к сильнопатогенным штаммам. В этом случае слабопатогенный штамм называют вакцинным. "Иммунитет" проявляется либо в удлинении срока появления симптомов заболевания, либо вообще в его отсутствие в течение всего времени вегетации, что приводит к уменьшению потерь и сохранению урожая (К.С.Сухов, Т.С.Подъяпольская, Извекова Л.И. Иммунизация растений против патогенного действия вирусов. М.: Наука, 1979).

Существуют вакцинные штаммы для защиты растений томата от вируса табачной мозаики томата: это ВТМ V-69 (Сухов К.С., Подъяпольская Т.С., Извекова Л.И. и др. Вакцинный штамм вируса табачной мозаики V-69: получение, свойства и практическое применение. Известия АН СССР. Серия биол. 1982, 1:113-125) и L11А (Nishiguchi М, Kikuchi S, Kiho Y, Ohno T, Meshi Т, Okada Y. Molecular basis of plant viral virulence; the complete nucleotide sequence of an attenuated strain of tobacco mosaic virus. Nucleic Acids Res. Aug 1985, 12; 13(15):5585-90). Ослабленные штаммы также используются для защиты перца от мягкой крапчатой мозаики перца (Ichiki TU, Nagaoka EN, Hagiwara K, Uchikawa K, Tsuda S, Omura Т.. Integration of mutations responsible for the attenuated phenotype of Pepper mild mottle virus strains results in a symptomless cross-protecting strain. Arch Virol. Oct; 150(10):2009-20. Epub 2005 Jun 22).

Нам не известны ослабленные штаммы ВЗКМО, используемые для защиты растений огурца. Выделение и применение таких штаммов может существенно повысить урожай, поскольку ВЗКМО в форме резкой зеленой мозаики поражает листья и плоды, вызывая значительные потери (до 40%). Вирус длительно сохраняется в семенах (1-2%) и затем быстро распространяется от растения к растению при ручной обработке, через почву и орудия труда.

Задачей данного изобретения являлось получение бессимптомного на растениях огурца вакцинного штамма ВЗКМО. Эта задача была решена с помощью штамма ВИРОГ-43М, который был получен в результате селекции патогенных штаммов ВЗКМО. Бессимптомные изоляты отбирались с помощью метода серодиагностики со специфической к ВЗКМО антисывороткой и препаративной очисткой. Штамм хранится в коллекции Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Штамм ВИРОГ-43М имеет следующие морфологические характеристики: форма вирионов - жесткая палочка размером 270×18 нм. На растениях огурца и кабачка бессимптомен.

Штамм ВИРОГ-43М накапливается в листьях огурца в меньшей концентрации (0,5-0,75 мкг/г свежей ткани), чем патогенный ВЗКМО (1,5-2,0 мкг/г).

Штамм ВИРОГ-43А относится к РНК-содержащим вирусам и имеет следующую первичную структуру генома:

1	GTTTTAATTT	TTATAATTAA	ACCAACAACA	ACAACAACAA	CAAACATTTT	AAAACAACAA
61	TGGCAAACAT	TAATGAACAA	ATCAACAATC	AACGTGATGC	TGCTGCTAGC	GGGAGAAATA
121	ATCTCGTTAG	TCAGCTAGCA	TCAAAGAGGG	TGTATGACGA	GGCCGTTCGC	TCGTTAGATC
181	ATCAAGATAG	ACGCCCAAAA	ATGAACTTTT	CTCGTGTGGT	CAGTACAGAG	CACACCAGGC
241	TTATCACCGA	TGCGTATCCG	GAGTTTTCGA	TTAGTTTCAC	CGCTACCAAG	AACTCAGTTC
301	ATTCCCTTGC	GGGAAGTCTG	AGGCTTCTTG	AATTGGAGTA	CATGATGATG	CAGGTACCTT
361	ATGGTTCACC	TTGCTTTGAT	ATTGGCGGTA	ATTACACGCA	GCATTTATTT	AAAGGCAGAT
421	CATATGTACA	TTGCTGCAAT	CCGTGCCTGG	ATCTTAAAGA	CGTTGCGAGG	AATGTGATGT
481	ACAATGACAT	AATTACGCAA	CATGTGCAGA	GGCATAAAGG	ATCTGGTGGA	TGCAGACCTC
541	TTCCGACTTT	CCAGATAGAT	GCTTTCAGGA	GGTACGAAGA	TTCGCCCGTT	GCAGTCACCT
601	GTCCAGACGT	TTTCCAAGAA	TGTTCCTATG	ATTTCGGGAG	TGGCAGGGAT	AATCATGCGG
661	TCTCATTGCA	TTCGATTTAT	GATATCCCTT	ATTCTTCGAT	CGGACCAGCT	CTTCATAGGA
721	AAAACGTGAG	AGTCTGTTAT	GCAGCCTTTC	ATTTCTCGGA	GGCGTTGCTC	TTAGGTTCGC
781	CCGTGGGTAA	TTTAAATAGT	ATAGGGGCTC	AATTTAGGGT	TGATGGTGAC	GATGTGCATT
841	TTCTTTTTAG	TGAGGAGTCA	ACTTTGCATT	ATACTCATAG	TTTAGAGAAT	ATTAAGTTAA
901	TCGTAATGCG	TACTTATTTT	CCTGCTGATG	ATAGGTTCGT	GTATATTAAG	GAGTTTATGG
961	TTAAGCGTGT	GGACACTTTC	TTCTTTAGGT	TGGTTAGGGC	AGACACACAT	ATGCTTCATA
1021	AATCTGTAGG	GCACTATTCG	AAGTCGAAAT	CTGAGTATTT	TGCGTTGAAC	ACCCCCCCGA
1081	TTTTTCAAGA	TAAGGCCACG	TTTTCTGTGT	GGTTTCCCGA	AGCGAAACGG	AAGGTGTTGA
1141	TACCTAAGTT	CGAACTCTCG	AGATTTCTTT	CTGGAAATGT	GAAAGTCTCT	AGGATGCTTG
1201	TCGATGCTGA	TTTTGTCCAT	ACCATTATTA	ATCACATTAG	CACGTACGAT	AACAAGGCTT
1261	TAGTGTGGAA	GAATGTTCAG	TCTTTTGTAG	AATCTATACG	CTCTAGGGTA	ATTGTAAACG
1321	GAGTTTCCGT	GAAATCTGAA	TGGAACGTGC	CGATCGATCA	GCTTACTGAT	ATCTCATTCT
1381	CGATATTCCT	TCTCGTGAAG	GTTAGAAAGG	TGCAGATTGA	GCTAATGTCT	GATAAGGTCG
1441	TGATCGAGGC	GAGGGGTTTG	CTTCGGAGGT	TCGCTGATAG	TCTTAAATCC	GCCGTAGAAG
1501	GACTAGGTGA	CTGCGTCTAT	GATGCTCTAG	TTCAAACCGG	TTGGTTTGAC	ACCTCCAGCG
1561	ACGAACTGAA	AGTATTGCTA	CCTGAACCGT	TTATGACCTT	TTCAGATTAC	CTCGAAGGGA
1621	TGTACGAGGC	AGATGCGAAA	ATTGAGAGAG	AGAGTGTCTT	TGAGCTGCTT	GCTTCTGGAG
1681	ATGATCTGTT	CAAGAAGATT	GATGAGATAA	GGAACAATTA	CAGCGGAGTT	GAATTTGATG
1741	TGGAGAAATT	TCAAGAATTC	TGTAAAGAAC	TGAATGTTAA	TCCCATGCTA	ATTGGTCATG
1801	TGATCGAAGC	TATTTTTTCG	CAGAAGGCAG	GGGTGACAGT	CACGGGCCTA	GGCACGCTCT
1861	CTCCTGAGAT	GGGTGCTTCC	GTTGCGTTGT	CCAATAATTC	TGTAGATACA	TGTGATGATA
1921	TGGATGTAAC	TGAGGATATG	GAGGAAATAG	TGTTGATGGC	AGACAAGAAT	CACTCTTACA
1981	TTTCTCCAGA	AATGTCGAGA	TGGGCTAATA	TGAAATATGG	CAATAATAAC	GGGGCCTTAG
2041	TTGAATACAA	GGTCGGAACC	TCGATGACTT	TACCTGCCAC	CTGGGCAGAA	AAGGGTAAGG
2101	CTGTCTTACC	GTTGTCGGGA	ATCTGTGTGA	GAAAGCCCCA	ATTTTCAAAG	CTACTCGATG
2161	AGGAGGACGA	CTTGAGGTTG	TCAAACATGA	ATTTCTTTAA	GGTGAGTGAT	CTAAAGTTAA
2221	AGAAGACTAT	CACTCCAGTT	GTTTATACTG	GGACCATTCG	AGAGAGGCAG	ATGAAGAATT
2281	ATATCGATTA	TCTATCGGCT	TCTCTGGGTT	CTACGCTTGG	TAATCTTGAG	AGAATTGTCA
2341	GGAGTGATTG	GAATGGTACC	GAGGAGAGCA	TGCAAACTTT	TGGATTGTAC	GATTGTGAGA
2401	AGTGCAAGTG	GTTGCTGTTA	CCATCCGAGA	AGAAACACGC	CTGGGCTGTA	GTCCTAGCGA
2461	GTGATGATAC	CACTCGTATA	ATCTTCCTGT	CGTATGATGA	ATCCGGTTCT	CCTATAATTG
2521	ATAAGAAAAA	TTGGAAGCGG	TTCGCTGTCT	GTTCTGATAC	TAAAGTTTAT	AGTGTGATTC
2581	GTAGTTTAGA	AGTCTTAAAT	AAGGAGGCCA	TAGTCGATCC	TGGGGTGCAT	ATAACTTTAG
2641	TCGATGGGGT	GCCGGGCTGT	GGAAAAACTG	CAGAAATTAT	AGCGAGGGTC	AATTGGAAAA
2701	CTGACCTTGT	GTTGACTCCC	GGAAGGGAAG	CGGCTGCTAT	GATCAGGCGA	AGAGCCTGTG

2761	CCCTGCACAA	3TCACCTGTA	GCTACTAGTG	ATAACGTTAG	GACTTTTGAC	TCTTTCGTAA
2821	TGAATAAGAA	3GTTTTTAAA	TTTGATGCCG	TTTATGTAGA	TGAGGGTCTT	ATGGTCCATA
2881	CGGGGTTGCT	CAACTTCGCG	TTGAAGATTT	CAGGTTGTAA	AAAAGCCTTT	GTCTTCGGTG
2941	ATGCTAAGCA	AATTCCGTTT	ATTAATAGGG	TTATGAATTT	TGATTATCCT	AAGGAATTAA
3001	GAACTTTAAT	AGTTGATAAC	GTAGAGCGTA	GGTATATTAC	CCATAGGTGT	CCTAGAGATG
3061	TCACTAGCTT	TCTTAATACT	ATTTATAAAG	CTGCGGTTTC	TACCACTAGT	CCGGTTGTAC
3121	ATTCCGTGAA	GGCAATAAAG	GTTTCTGGGG	CTGGTATTCT	GAGGCCCGAG	TTGACGAAGA
3181	TCAAAGGGAA	GATCATAACG	TTTACTCAGT	CTGATAAACA	ATCCTTGATC	AAGAGTGGGT
3241	ACAATGATGT	GAATACTGTG	CATGAGATTC	AAGGGGAGAC	CTTTGAGGAA	ACGGCGGTTG
3301	TACGTGCGAC	ACCGACTCCA	ATAGGTCTGA	TTGCTCGAGA	TTCACCACAC	GTGTTGGTGG
3361	CTTTAACGCG	GCATACCAAG	GCAATGGTGT	ATTATACCGT	TGTGTTCGAT	GCCGTTACAA
3421	GCATAATAGC	AGATGTGGAA	AAGGTCGATC	AGTCAATTCT	GACCATGTTT	GCTACTACTG
3481	TGCCTACCAA	ATAGCAATTA	ACGCAGAACT	CTCTGTATGT	TCACCGCAAT	ATTTTCCTCC
3541	CTGTCACTAA	GACAGGGTTT	TATACGGATA	TGCAGGAGTT	CTATGATAGG	TGCCTTCCAG
3601	GGAATTCCTT	TGTTTTGAAC	GATTTCGATG	CCGTCACCAT	GCGGTTGAGG	GATAACGAAT
3661	TTAATTTGCA	ACCTTGTAGA	TTAACTTTAA	GTAATTTAGA	TCCGGTGCCG	GCTTTGATCA
3721	AGAGTGAGGC	AAAAGATTTT	CTGGTTCCCG	TATTGCGAAC	GGCTTGCGAA	AGGCCACGTA
3781	TTCCGGGTCT	TCTCGAAAAT	CTTGTTGCTA	TGATAAAGAG	GAATATGAAT	ACTCCTGATT
3841	TGGCTGGAAC	CGTGGACATA	ACTAACATGT	CTATTTCTAT	AGTAGATAAT	TTCTTTTCTT
3901	CCTTTGTTAG	GGACGAGGTT	CTACTTGATC	ATTTAGATTG	CGTTAGAGCT	AGTTCTATGC
3961	AGAGTTTTTC	TGATTGGTTT	TCTTGTCAGC	CAACCTCGGC	GGTTGGCCAG	TTAGCTAATT
4021	TTAATTTCAT	AGATTTACCT	GCCTTTGATA	CATATATGCA	TATGATTAAG	AGGCAGCCTA
4081	AGAGTCGGTT	AGATACTTCA	ATTCAGTCCG	AATATCCGGC	CTTGCAAACT	ATTGTATATC
4141	ATCTGAAGGT	GGTAAACGCA	GTTTTCGGGC	CGGTTTTTAA	GTATCTGACT	ACTAAGTTTC
4201	TTAGCATGGT	AGATAATTCT	AAGTTTTTCT	TTTATACTAG	AAAAAAGCCA	GAGGATCTGC
4261	AGGAGTTTTT	CTCGGATCTT	TCTTCCCATT	CTGATTATGA	AATTCTTGAG	CTCGATGTTT
4321	CTAAATATGA	TAAGTCGCAG	TCCGATTTCC	ATTTCTCCAT	CGAGATGGCA	ATTTGGGAAA
4381	GGCTAGGACT	AGATGATATT	TTAGCTTGGA	TGTGGTCCAT	GGGTCATAAG	AGAACTATAC
4441	TGCAAGACTT	CCAAGCTGGA	ATAAAGACGC	TCATTTATTA	TCAAAGGAAG	TCTGGTGATG
4501	TAACTACTTT	TATAGGTAAT	ACTTTTATTA	TTGCAGCGTG	CGTAGCTAGT	ATGTTACCGT
4561	TAGATAAGTG	TTTTAAGGCT	AGTTTTTGTG	GTGATGATTC	GTTAATCTAC	CTTCCTAAGG
4621	GTTTGGAGTA	TCCTGATATT	CAGGCTACCG	CCAATTTGGT	TTGGAATTTT	GAGGCGAAAC
4681	TTTTCCGGAA	GAAGTATGGT	TACTTCTGCG	GGAAATATAT	CATTCATCAC	GCCAACGGCT
4741	GTATTGTTTA	CCCTGACCCT	TTAAAGTTAA	TTAGTAAATT	AGGTAGTAAG	AGTCTTGTCG
4801	GGTATGAGCA	TGTCGAGGAG	TTTCGTATAT	CTCTCCTTGA	TGTCGCTCAT	AGTTTGTTTA
4861	ATGGTGCTTA	TTTCCATTTG	CTCGACGATG	CAATCCACGA	GTTGTTTCCT	AATGCTGGGG
4921	GTTGCAGTTT	TGTAATAAAT	TGTTTGTGTA	AGTACTTGAG	TGATAAGCGC	CTTTTCCGTA
4981	GTCTTTATAT	AGATGTCTCT	AAGTAAGGTG	TCGGTCGAGA	ACTCGTTGAA	ACCTGAGAAA
5041	TTCGTTAAAA	TTTCCTGGGT	TGACAAGTTG	CTCCCTAATT	ACTTTTCTAT	TCTTAAGTAC
5101	CTATCTATAA	CTGACTTTAG	TGTAGTTAAA	GCTCAGAGTT	ATGAATCCCT	CGTGCCTGTC
5161	AAGTTGTTGC	GTGGTGTTGA	TCTTACAAAA	CACCTTTATG	TCACACTGTT	GGGCGTTGTG
5221	GTTTCTGGTG	TATGGAACGT	ACCGGAATCC	TGTAGGGGTG	GTGCTACTGT	TGCTTTGGTT
5281	GACACAAGGA	TGCATTCTGT	TGCAGAAGGA	ACTATATGCA	AATTTTCAGC	TCCCGCCACC
5341	GTCCGCGAAT	TCTCTGTTAG	GTTCATCCCT	AACTATTCTG	TCGTGGCTGC	GGATGCCCTT
5401	CGCGATCCTT	GGTCTTTATT	TGTAAGGCTC	TCTAACGTAG	GTATTAAGGA	TGGTTTTCAT
5461	CCATTAACTT	TAGAGGTCGC	CTGTTTAGTT	GCCACTACTA	ATTCTATTAT	AAAAAAGGGG
5521	CTTAGAGCTT	CTGTAGTTGA	GTCTGTTGTC	TCTTCCGATC	AGTCGATTGT	TCTAGATTCT

5581	TTATCTGAGA	AAGTTGAGCC	TTTCTTCGAT	AAAGTCCCTA	TTTCAGCGGC	CGTAATGGCG
5641	AGAGACCCCA	GTTATAGGTC	TAGGTCGCAG	TCTGTCGTTG	GTCGTGGTAA	GCGGCATTCT
5701	АААССТССАА	ATCGGAGGTC	GGACTCTGCT	TCTGAAGAGT	CCAGTTCTGT	ATCTTTCGAA
5761	GATGGCTTAC	AATCCGATCA	CGCCTAGCAA	ACTTATTGCG	TTTAGTGCTT	CCTATGTTCC
5821	CGTTAGAACT	ТТАСТТААТТ	TTCTAGTGGC	GTCGCAAGGT	ACTGCTTTCC	AAACTCAGGC
5881	AGGAAGAGAT	TCCTTCCGTG	AGTCTTTGTC	TGCGTTACCT	TCATCTGTTG	AAGATATTAA
5941	TTCTAGGTTC	CCGAGTGCGG	GTTTTTACGC	ТТТССТСААС	GGTCCTGTGT	TGAGGCCTAT
6001	CTTCGTTTCG	CTTCTTAGCT	CTACGGATAC	GCGTAATAGG	GTCATTGAGG	TTGTAGATCC
6061	TAGCAATCCG	ACGACTGCTG	AGTCGCTTAA	CGCAGTCAAG	CGTACTGACG	ATGCGTCTAC
6121	AGCCGCTAGG	GCTGAGATAG	ATAATTTGAT	AGAGTCTATC	TCTAAGGGGT	TTGATGTTTA
6181	TGACAGGGCT	TCTTTTGAAG	CCGCGTTTTC	GGTAGTCTGG	TCAGAGGCTA	ССАССТСТАА
6241	GGCTTAGCCT	TGAGGGTCTT	CTGACGGTGG	TGCACACCAT	AGTGCATAGT	GCTTTCCCGT
6301	ТСАСТТТААТ	CGAACGGTTT	GCTCATTGGT	TTGCGAAAAC	CTCTCGCGTG	TGACGCTGAA
6361	GTTTTTATGG	GCAGTAATTC	TGCAAGGGGT	TCGAATCCCC	CCTTTCCCCG	GGTAGGGGCC
6421	СА

Первичную структуру вирусной РНК ВИРОГ-43М определяли с помощью автоматического секвенирования фрагментов кДНК, полученных методом праймер-опосредованной «прогулки по геному».

Для получения вакцины штамм сначала накапливают в растениях огурца в течение трех недель после заражения при температуре 18-25°С. Затем проводят выделение ослабленного штамма из листьев огурца и его очистку по методике. Такой препарат может храниться в ампулах в течение 1,5-3 лет при +5°С.

Вакцинация в производственных условиях осуществляется путем опрыскивания 10-12-дневных сеянцев огурца в стадии 1-2 развернутых настоящих листьев водным раствором вакцинного препарата с помощью бытовых пылесосов и прилагаемых к ним распылителей не менее чем за 3-4 дня до высадки в грунт.

Пример 1. Эксперименты по испытанию свойств штамма ВИРОГ-43М проводили в условиях лабораторных теплиц в трехкратной повторности по 100 растений в каждом опыте (таблица 1).

Таблица 1
Длительность сохранения бессимптомности ВИРОГ-43М в условиях лабораторного опыта и интерференция с патогенным штаммом ВЗКМО
Варианты опыта*	Число бессимптомных растений в %				Число растений с симптомами резкой мозаики, %
Время испытания после заражения ВИРОГ-43М	Время испытания (месяцы)				Время испытания (месяцы)
	1,5	2,0	2,5	3,0	1,5	2,0	2,5	3,0
ВИРОГ-43М	100	100	98,0	98,0	0	0	2,0	2,0
ВИРОГ-43М + ВЗКМО (через 2 недели после заражения ВИРОГ-43М)	98,0	95,0	93,0	85,0	2,0	5,0	7,0	15,0
ВЗКМО	0	0	0	0	100	100	100	100
* Для заражения использовали препараты вирусов в концентрации 0,5 мкг/мл

В условиях лабораторного эксперимента растения огурца, зараженные ВИРОГ-43М, остаются бессимптомными в течение трех месяцев испытаний (табл.1), что свидетельствует о высокой генетической стабильности штамма ВИРОГ-43М.

Штамм ВИРОГ-43М обладает способностью к интерференции с патогенными штаммами ВЗКМО, так как обладает вакцинными свойствами, которые проявляются в длительном сохранении бессимптомности у вакцинированных растений после заражения их резким мозаичным штаммом ВЗКМО (табл.1).

Пример 2. Производственные испытания проводили в ЗАО агрокомбината «Московский» на площади по 1 га вакцинированных и невакцинированных посадок.

Таблица 2
Подавление развития мозаичного заболевания ВЗКМО на посадках огурца, обработанных ВИРОГ-43М
Варианты опыта и гибриды огурца	Сроки наблюдений через 1 месяц после обработки ВИРОГ-43М и % резкой мозаики ВЗКМО в летнем обороте
	1-й месяц	2-й месяц	3-й месяц	4-й месяц
ВИРОГ-43М 0,5 мг/мл; F1 Кураж	0,1	2,0	3,2	7,5
Без обработки	2,0	12,2	34,1	51,5
ВИРОГ-43М,0,5 мг/мл; F 1 Пассалимо	5,4	11,0	19,3	34,2
Без обработки	3,7	25,0	48,0	82,9

Исходя из приведенных в таблице данных, можно сделать вывод, что штамм ВИРОГ-43М обладает бессимптомностью, генетической стабильностью и способностью к интерференции с патогенными штаммами ВЗКМО. Следовательно, данный штамм может быть использован в практике защиты растений огурца от патогенного ВЗКМО, где на фоне резкой мозаики можно ожидать прибавки урожая не менее 25-30%.