способ определения показаний к проведению органосохраняющего лечения больных раком мочевого пузыря

Формула изобретения

Способ определения показаний к проведению органосохраняющего лечения больных раком мочевого пузыря путем взятия пробы крови, гамма-облучения части этой пробы in vitro, инкубации облученной и необлученной частей пробы крови и окрашивания ДНК компонентов обеих частей крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, отличающийся тем, что определяют количество лейкоцитов L _o в облученной части пробы крови, количество лейкоцитов L_н в необлученной части пробы крови и отношение L_o/L_н затем осуществляют окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови, определяют ИД_о - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_н - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит необлученной части пробы, вычисляют ИД_н/ИД_о и L_o/L_н и при значениях обоих указанных отношений более 1,0 считают показанным проведение органосохраняющего лечения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при определении наиболее рациональной тактики лечения больных с раком мочевого пузыря (РМП), представляющим собой солидное новообразование.

Известен способ определения показаний к проведению органосохраняющего лечения, а именно химиотерапии (XT), больным лимфогранулематозом и распространенным раком молочной железы, также являющимся солидным новообразованием; согласно способу определяют число нейтрофилов крови пациента и при уровне числа нейтрофилов от 1,8 до 10,0×10⁹ кл/л исследуют лейкоциты периферической крови после гамма-облучения в дозе 2 Гр, инкубируют облученную и необлученную пробы в течение 3 ч при 37°С, определяют в них содержание ДНК лейкоцитов и рассчитывают показатель чувствительности (S) как отношение концентрации ДНК для лейкоцитов необлученной пробы к концентрации ДНК лейкоцитов облученной пробы и при величине нейтрофилов в пределах 1,8-10,0×10⁹ кл/л и значении величины S-показателя ниже 1,0 считают, что больному, в случае первичного генерализованного лимфогранулематоза, показано проведение комбинированной терапии по схеме ВЕАСОРР - блеомецином, этопозидом, доксорубицином, циклофосфамидом, винкристином, прокарбозином и преднизолоном, при значении величины S-показателя ниже 0,8 считают, что больному, в случае первичного распространенного рака молочной железы, показано проведение стандартного курса комбинированной химиотерапии по схеме CMF - циклофосфаном, метотрексатом, 5-фторурацилом, а при значении S-показателя выше 0,8 считают, что больному, в случае первичного распространенного рака молочной железы, показано проведение курса комбинированной химиотерапии по схеме FAC - 5-фторурацилом, доксорубицином, циклофосфаном, RU 2212035 C2.

Данный способ малоэффективен при определении показаний к проведению органосохраняющего лечения больных РМП.

Радикальным методом лечения инвазивного рака мочевого пузыря (РМП) является цистэктомия. В то же время следует учитывать, что РМП - болезнь пожилого возраста, и не всем больным можно выполнить такую радикальную операцию из-за сопутствующей патологии. Кроме того, известно о снижении качества жизни после удаления мочевого пузыря. В результате многие пациенты, получив информацию о необходимости полного удаления этого органа, отказываются от предлагаемого лечения. Вместе с тем к настоящему времени установлено, что не всем больным с инвазивным и местно-распространенным РМП необходимо полное удаление органа и в определенной группе больных можно добиться регрессии опухоли, используя консервативные методы лечения. Однако при органосохраняющем лечении мочевого пузыря возрастает степень риска, связанная с возможным рецидивом заболевания, развитием регионарных или отдаленных метастазов. Прогнозировать эффективность такого лечения и дальнейшее развитие болезни пока еще очень трудно. Одним из подходов в решении этой проблемы представляется целенаправленный отбор больных для органосохраняющего лечения. Несмотря на наличие таких высокоинформативных методов исследования, как компьютерная и ядерно-магнитно-резонансная томография, разница при определении распространенности опухолевого поражения до и после лечения довольно существенна. Ошибка при установлении клинического диагноза встречается в 45-70% случаев, что в значительной степени осложняет прогноз течения болезни.

К настоящему времени известно, что своеобразным критерием отбора больных для органосохраняющего лечения может быть ответ на индукционную химиотерапию (XT), который коррелирует с чувствительностью РМП к комбинированному лечению. Выживаемость больных, имевших полный ответ на XT, была выше, чем у резистентных. Однако определение наиболее раннего ответа на такую индукционную XT требует, по крайней мере, 6-14-дневного периода и, кроме того, возникают сложности при необходимости изменения последующей тактики лечения у пациентов, не имевших достаточной величины (полноты) ответа или имевших частичный ответ на подведенную XT (у которых должна быть проведена радикальная цистэктомия после такого лечения).

Известен способ определения показаний к проведению органосохраняющего лечения больных РМП путем взятия пробы крови, выделения лимфоцитов, гамма-облучения лимфоцитов части этой пробы in vitro, инкубации лимфоцитов облученной и необлученной частей пробы крови и окрашивания лимфоцитов ДНК-специфичным флуоресцентным красителем; затем определяют содержание ДНК в облученных и необлученных лимфоцитах и при установлении снижения содержания ДНК в облученных лимфоцитах в сравнении с необлученными считают, что больному показано органосохраняющее лечение, в частности химиолучевая терапия, см. М.Ozsahin и др. «Radiation-Induced Late Toxicity Can Be Predicted by CD4 and CD8 T-Lymphocyte Apoptosis: Results of a Prospective Study in 399 Individual Consenting Patients», I.J.Radiation Oncology. Biology. Physics. Volume 57, Number 2, Supplement, 2003, USA, p.p.203-204 (копия ссылки прилагается).

Данный способ принят в качестве прототипа настоящего изобретения.

Недостатком этого способа является то, что учитываются реакции только в лимфоцитах, которые составляют при солидных опухолях не более 30% от общего числа лейкоцитов. Это не всегда позволяет сделать достоверное заключение о наличии показаний к проведению органосохраняющего лечения. В частности, в указанном выше источнике (М.Ozsahin и др., р.203) отмечается, что при РМП реакция CD4 лимфоцитов на тест облучения недостоверна (p=NS for CD4).

Таким образом, способ-прототип не обладает достаточной надежностью при определении показаний к проведению органосохраняющего лечения больных РМП.

Задачей настоящего изобретения является повышение надежности способа определения показаний к проведению органосохраняющего лечения больных РМП.

Согласно изобретению в способе определения показаний к проведению органосохраняющего лечения больных раком мочевого пузыря путем взятия пробы крови, гамма-облучения части этой пробы in vitro, инкубации облученной и необлученной частей пробы крови и окрашивания ДНК компонентов обеих частей крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, определяют количество лейкоцитов L_o в облученной части пробы крови, количество лейкоцитов L_н в необлученной части пробы крови и отношение L_o/L _н, затем осуществляют окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови, определяют ИД_о - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит облученной части пробы и ИД_н - количество ДНК во всех ДНК-содержащих компонентах в расчете на один лейкоцит необлученной части пробы, вычисляют ИД_н /ИД_о и L_o/L _н, и при значениях обоих указанных отношений более 1,0 считают показанным проведение органосохраняющего лечения.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Определение суммарной концентрации ДНК в пробе крови позволяет более полно оценить реакции на облучение, так как учитывает все ДНК-содержащие компоненты, а не только реакции в лимфоцитах. Значительное количество ДНК содержится в гранулоцитах крови, которые могут составлять до 70% всех периферических лейкоцитов, кроме того, в кровотоке онкологических больных имеются ДНК-содержащие опухолевые клетки, наконец, также известно о наличии циркулирующей ДНК в плазме/сыворотке крови. Каждый из перечисленных компонентов дает свой вклад в повышение надежности способа.

Указанные обстоятельства позволяют сделать вывод о соответствии заявленного изобретения критерию «изобретательский уровень».

Заявленный способ реализуют следующим образом.

У больного РМП берут 2,0 мл венозной крови, добавляют гепарин до 25 ед/мл, а также 2,0 мл раствора Хенкса. Смесь делят на две примерно равные части. Одну часть подвергают гамма-облучению в дозе 2 Гр, другая часть смеси остается необлученной. Обе части инкубируют при 37°С в течение 3 часов. После этого в каждой части пробы определяют общее количество лейкоцитов с помощью камеры Горяева и вычисляют отношение количества лейкоцитов в облученной части пробы (Л _о) к количеству лейкоцитов в необлученной части пробы (Л _н). Перед окрашиванием 0,05 мл каждой части пробы обрабатывают 10-кратным объемом лизирующей смеси, содержащей 0,5% тритон Х-100, 2М NaCl, 0,1 М Na₂EDTA и 0,01 М трис при рН 8,0 в течение 3-5 минут до просветления. Далее осуществляют окрашивание всех ДНК-содержащих компонентов крови ДНК-специфичным флуоресцентным красителем, в частности, 4:6-диамидино-2-фенилиндолом (ДАФИ). Для этого измеряют интенсивность флуоресценции при _ВОЗБ=350 нм и _ЭМ=450 нм у лизированной пробы (I ₀), затем к пробе добавляют 0,05 мл раствора ДАФИ в концентрации 4 мкг/мл и измеряют интенсивность флуоресценции - I ₁, после чего к пробе добавляют 0,02 мл раствора стандартной ДНК в известной концентрации и определяют интенсивность флуоресценции - I₂. Концентрацию ДНК, нормированную на один лейкоцит (Л) в анализируемых пробах, рассчитывают по формуле:

где К - коэффициент, зависящий от разбавления проб и стандарта, а также от концентрации стандарта (К - при одинаковых условиях измерения является величиной постоянной).

Определив индексы ИД_н в необлученной и ИД _о в облученной частях пробы, вычисляют отношение ИД _н/ИД_о.

При значениях L _o/L_н и ИД_н/ИД _о более 1,0 считают целесообразным проведение органосохраняющего лечения.

Пример 1.

Анамнез - больной К-в B.C. 54 года. Поступил в Клинику ЦНИРРИ с диагнозом: «переходноклеточный РМП», Т2-стадия.

К 2,0 мл гепаринизированной (25 ед/мл) цельной венозной пробы крови пациента добавили 2,0 мл раствора Хенкса. Получившуюся смесь разделили на 2 части. Одну из них облучили в дозе 2 Гр на гамма-установке «Луч-1» (мощность дозы 0,4 Гр/мин), другая служила контролем. Обе части пробы инкубировали при 37°С в течение 3 ч в термостате. После этого в обеих пробах определяли концентрации лейкоцитов с помощью камеры Горяева и отношение L_o/L_н =1,10.

Затем в обеих частях пробы определяли концентрацию ДНК с помощью флуоресцентного красителя. Для этого к 0,05 мл пробы проинкубированной крови добавляли 0.5 мл лизирующей смеси, содержащей 0,5% тритон Х-100, 2М NaCl, 0,1 М Na ₂EDTA и 0,01 М трис при рН 8,0, в течение 3-5 мин до просветления и 0,05 мл лизированной пробы добавляли к 1,0 мл трис-буфера. Интенсивность флуоресценции образца измеряли на спектрофлуориметре фирмы «Хитачи» (Япония) Model-850 _ВОЗБ=350 нм и _ЭМ=450 нм. В данном случае у необлученной лизированной пробы I₀=8,5, затем к пробе добавляли 0,05 мл раствора ДАФИ в концентрации 4 мкг/мл и измеряли интенсивность флуоресценции - I₁=28,3, после чего к пробе добавили 0,02 мл раствора соницированной ДНК тимуса теленка фирмы «Серва» (Германия) в концентрации 25 мкг/мл и определили интенсивность флуоресценции - I₂ =45,4.

Определив количество ДНК в расчете на 1 лейкоцит, в необлученной и облученной пробах рассчитали величину ИД _н/ИД_о=1,44. Так как значения ИД _н/ИД_о и L_o/L _н больше 1,0, было сделано заключение о возможном проведении комбинированной органосохраняющей терапии больному К-ву. Последующее определение длительности безрецидивного периода показало, что рецидивов заболевания у больного не было в течение 23 мес.

Для сравнения приводим результаты лечения другого больного, которому в соответствии с нашими показаниями комбинированное органосохраняющее лечение не было рекомендовано, но оно все-таки было проведено.

Анамнез - больной Ж-в Н.Ф. 79 лет. Поступил в клинику ЦНИРРИ с диагнозом: «переходноклеточный РМП», Т2-стадия.

Величина L_o/L_н =0,83, а величина ИД_н/ИД _о=0,86, что не являлось показанием проведения органосохраняющего комбинированного лечения. Несмотря на это, такое лечение было осуществлено, и в результате обнаружилось, что рецидив заболевания произошел уже через 2 месяца после окончания органосохраняющей терапии, что привело к осложнению всего лечения.

Результаты определения показаний к проведению органосохраняющего лечения 20 больных и данные клинических наблюдений, полученные в результате лечения, продемонстрировали, что у больных с L _o/L_н>1,0 и ИД_н /ИД_о>1,0 длительность безрецидивного периода после органосохраняющей терапии составляла 14,5±3,0 месяцев. В то же время 16 больным с L_o/L _н<1,0 и/или ИД_н/ИД _о<1 была проведена, несмотря на рекомендации, следующие из заявленного способа, органосохраняющая терапия. В этом случае длительность безрецидивного периода составила 6,5±0,7 месяцев.