способ определения дигидрокверцетина

Формула изобретения

Способ определения дигидрокверцетина, включающий подготовку субстрата растительного сырья и ВЭЖХ-анализ, отличающийся тем, что сухой этилацетатный экстракт растворяют в 0,01 М фосфатном буфере с рН 7,3-7,7, а в качестве мобильной фазы для ВЭЖХ-анализа используют смесь ацетонитрила, 0,0025-0,0075 М NaH ₂PO₄ (рН 2,8-3,5) и изопропанола в соотношении 30:69:1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологической химии растений и касается определения дигидрокверцетина в растительном сырье.

Дигидрокверцетин (3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон) (диквертин, кверцетин, ДКВ) - биологически активное соединение, основным промышленным источником которого является древесина лиственницы сибирской (Larix sibirica). Данное вещество также известно под названием таксифолин, так как ранее был выделен из коры дугласовой пихты (Pseudotsuga taxifolia) [1]. ДКВ обладает широким спектром биологической активности: антидиабетической [2] антиоксидантной [3], противоопухолевой [4, 5], противоаллергической и противовоспалительной [6, 7], низкой мутагенной активностью и токсичностью [8]. ДКВ является более активным и стабильным антиокислителем, чем токоферолы и каротиноиды [9].

У препарата отмечены следующие фармакологические эффекты: антиоксидантный, ангиопротекторный, регенерирующий, дезинтоксикационный, противоотечный. Данное соединение тормозит процессы перекисного окисления липидов клеточных мембран, препятствуя их разрушению, оказывает капилляропротекторное действие, а также обладает антиатерогенным свойством, уменьшает риск возникновения инфарктов и инсультов. При его применении наблюдаются улучшение коронарного кровотока, сократимости миокарда, нормализация возбудимости и проводимости. Показана его эффективность при ревматизме, септическом эндокардите и вегетососу диетой дистонии [10, 11].

Важнейший вывод на основании фармакологических исследований состоит в том, что ДКВ может играть протекторную роль в отношении развития кардиосклероза, особенно при такой патологии, как сердечная недостаточность или инфаркт миокарда, а также в отношении защиты печени от различных видов поражения [12].

Для оценки его чистоты и количественного содержания используются различные методы исследования, но наиболее чувствительным и быстрым является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Известен способ определения ДКВ методом И.В. Воскобойниковой и соавторов (1992) [13], заключающийся в том, что стандартный раствор ДКВ и сухой экстракт в концентрации 10 мг/мл готовят в ацетонитриле и разводят в 100 раз смесью ацетонитрил:2% уксусная кислота в соотношении 30:70 по объему (подвижная фаза). В хроматограф вводят 20 мкл раствора. Для построения калибровочной кривой готовят растворы ДКВ концентрации от 10 до 100 мкг/мл путем разбавления исходного стандартного раствора подвижной фазой. ВЭЖХ-анализ проводят на обращенно-фазовой колонке Lichrosorb 10 RP-2 250×4,6 мм со скоростью 500 мкл/мин; подвижная фаза ацетонитрил:2% уксусная кислота в соотношении 30:70 по объему; в изократическом режиме с УФ-детекцией при длине волны 290 нм. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию ДКВ в исследуемом образце по высоте пика стандарта. Время удерживания ДКВ - 11 мин, предел детекции - 0,2 мкг/мл.

Однако данный способ определения ДКВ имеет недостатки: 1) способ недостаточно чувствителен за счет того, что в качестве одного из компонентов элюента используют водный раствор уксусной кислоты, который обладает высокой оптической плотностью и увеличивает соотношение сигнал/шум, что вызывает снижение точности определения ДКВ; 2) длительность проведения анализа за счет того, что указанный компонент увеличивает вязкость элюента, что приводит к увеличению времени анализа, кроме того, снижается срок службы колонки за счет создания высокого давления данным компонентом элюента. Ширина пика ДКВ на хроматограмме составила 2,5 мин.

В качестве прототипа взят способ определения ДКВ по Е.П.Храмовой (2004) [14], заключающийся в том, что для анализа применяют водно-метанольный экстракт растения, который предварительно наносят на концентрирующий патрон «Диапак С16» (АО «Биохиммак»), элюируют 1 мл 100% метанола и 20 мкл элюента вводят в петлю инжектора хроматографа. Анализ проводят на обращенно-фазовой колонке «Диасфер-110-С16» 150×2 мм с размером частиц 5 мкм со скоростью 0,5 мл/мин; подвижная фаза - 48%-й метанол в 0,5%-м водном растворе фосфорной кислоты; в изократическом режиме с УФ-детекцией при 370 нм. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию ДКВ в экстракте по высоте пика стандарта. Время удерживания ДКВ - 6,7 мин.

Однако данный способ за счет необходимости экстрагирования ДКВ на концентрирующем патроне «Диапак С16» удлиняет время исследования. Способ недостаточно чувствителен, так как в качестве элюента применяется 48%-й метанол, использование которого обуславливает широкие пики [15], что существенно затрудняет расчеты концентрации и снижает точность определения. Кроме этого, при использовании подвижной фазы с большим содержанием метанола на колонке с диаметром 2 мм резко увеличивается давление, что неблагоприятно действует на колонку, уменьшая срок ее службы.

Для повышения точности способа и скорости определения ДКВ используют ВЭЖХ-анализ этилацетатного экстракта лекарственных растений, который растворяют в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,3-7,7), а в качестве мобильной фазы используют смесь ацетонитрила, 0,0025-0,0075 М NaH₂ PO₄ (рН 2,8-3,5) и изопропанола в соотношении 30:69:1.

Способ осуществляют следующим образом. Для анализа используют стандарт ДКВ и этилацетатный экстракт растения, которые растворяют в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,3-7,7) в концентрации 100 мкг/мл. Объем вводимого в петлю инжектора стандарта и пробы - 5 мкл. Анализ проводят на обращено-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом «Диасфер C₁₈» размером частиц 5 мкм + предколонка с C₁₈ 4×3 мм (Phenomenex, USA) со скоростью 500 мкл в мин, давление 40 бар, в качестве мобильной фазы используют смесь ацетонитрила, 0,0025-0,0075 М NaH₂PO₄ (рН 2,8-3,5) и изопропанола в соотношении 30:69:1; в изократическом режиме с УФ-детекцией при 290 нм. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию ДКВ в экстракте по высоте пика стандарта. Время удерживания ДКВ - 3,39 мин, предел детекции - 10 нг/мл.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что для анализа применяется этилацетатный экстракт растения, что позволяет получить экстракты особой чистоты и значительно продлить срок эксплуатации колонки. Если в прототипе в качестве мобильной фазы используют 48%-й метанол в 0,5%-м водном растворе фосфорной кислоты, то в предлагаемом способе используют смесь ацетонитрила, 0,0025-0,0075 М NaH₂ PO₄ (pH 7,3-7,7) и изопропанола в соотношении 30:69:1, так как: а) применение ацетонитрила позволяет получать высокие и узкие пики, что повышает чувствительность и точность способа, а метанол обусловливает широкие «размытые» пики; б) изопропанол применяют в качестве стабилизатора времени удерживания, так как чем стабильнее время удерживания, тем специфичнее идентификация вещества. Параметры используемых фосфатного буфера и мобильной фазы (молярность, pH, соотношение) определены экспериментальным путем, при которых регистрируют максимальную точность и минимальное соотношение сигнал/шум, что позволяет улучшить предел детекции определяемого вещества.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Сухой экстракт клубней зопника клубненосного (Phlomis tuberosa L.) растворяют в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,3-7,7) в концентрации 100 мкг/мл. Объем вводимого в петлю инжектора пробы 5 мкл. Анализ проводят на обращено-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом «Диасфер С₁₈» размером частиц 5 мкм + предколонка с C₁₈ 4×3 мм (Phenomenex, USA) со скоростью 500 мкл в мин, давление 40 бар, в качестве мобильной фазы используют смесь ацетонитрила, 0,0025-0,0075 М NaH₂PO₄ (pH 2,8-3,5) и изопропанола в соотношении 30:69:1; в изократическом режиме с УФ-детекцией при 290 нм.

Для регистрации хроматограмм используют программно-аппаратный комплекс «Multichrom for Windows» («Амперсенд», Россия). Время удерживания пика стандарта ДКВ - 3,39±0,1 мин, высота - 19,7 мВ.Время удерживания пика ДКВ пробы - 3,43±0,5 мин, высота - 1,95 мВ (чертеж). Ширина пика стандарта ДКВ - 0,4 мин, ширина пика ДКВ в пробе - 0,3 мин, предел детекции - 10 нг/мл. Конечная концентрация ДКВ в исследуемом образце составила 3,98 мкг/мл.

Пример 2. Сухой экстракт корней шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis G.) растворяют и анализируют аналогично примеру 1. Время удерживания пика стандарта ДКВ - 3,43±0,1 мин, высота - 19,7 мВ. Время удерживания пика ДКВ пробы - 3,4±0,5 мин, высота - 20 мВ (фигура). Ширина пика стандарта ДКВ - 0,4 мин, ширина пика ДКВ в пробе - 0,4 мин, предел детекции - 10 нг/мл. Конечная концентрация ДКВ в исследуемом образце составила 40 мкг/мл.

Данным способом проведено 20 исследований экстрактов лекарственных растений (табл.).

Таблица
Параметры определения ДКВ различными способами
	Прототип	Заявляемый способ
Время удерживания	6,7 мин	3,4±0,35 мин
Предел детекции	100 нг/мл	10 нг/мл

Воспроизводимость способа оценивали по значению коэффициента вариации (V):

V=(S/M)·100%,

где S - среднеквадратичное отклонение, М - средняя арифметическая. Коэффициент вариации (V) способа составил 5,9%.

Таким образом, предлагаемый способ является более точным, быстрым, менее трудоемким и обладает высокой воспроизводимостью.

Список используемой литературы:

1. Антонова Г.Ф., Тюкавкина Н.А. // Химия древесины. - 1983. - №2. - С.89-96.

2. Haraguchi H., Ohmi I., Fukuda A., Tamura Y., Mizutani K., Tanaka O., Chou W.H. Inhibition of aldose reductase and sorbitol accumulation by astilbin and taxifolin dihydroflavonols in Engelhardtia chrysolepis // Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, Apr.; 61 (4):651-654.

3. Kolhir V.K., Tyukavkina N.A., Bykov V.A. et al. Diquertin - new antioxidant and vasoprotector // Chem. - Farm. Jour. - 1995. - №9. P.61-64.

4. Chu S.C., Hsieh Y.S., Lin J.Y. Inhibitory effects of flavonoids on Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase activity // J. Nat. Prod., 1992, Feb., 55 (2):179-183.

5. Kandaswami С., Perkins E., Drzewiecki G., Soloniuk D.S., Middleton E.Jr. Differential inhibition of proliferation of human squamous cell carcinoma, gliosarcoma and embryonic fibroblast-like lung cells in culture by plant flavonoids // Anticancer. Drugs, 1992, Oct; 3 (5):525-530.

6. Bronner С., Landry Y. Kinetics of the inhibitory effect of flavonoids on histamine secretion from mast cells // Agents Actions, 1985, Apr.; 16 (3-4):147-151.

7. Schwarz A., Middleton E.Jr. Comparison of the effects of quercetin with those of other flavonoids on the generation and effector function of cytotoxic Т lymphocytes // Immunopharmacology, 1984, Apr.; 7 (2):115-126.

8. Jurado J., Alejandre-Duran E., Alonso-Moraga A., Pueyo C. Study on the mutagenic activity of 13 bioflavonoids with the Salmonella Ara test // Mutagenesis, 1991, Jul.; 6 (4):289-295.

9. Кравченко Л.В., Морозов С.В., Авреньева Л.И., Бабкин В.А., Тутельян В.А. Оценка антиоксидантной и антитоксической эффективности природного флавоноида дигидрокверцетина // Токсикол. вестник. - 2005. - №1. - С.14-20.

10. Средство для комплексной терапии заболеваний «Диквертин»: получение, стандартизация, фармакологические свойства и клинические исследования. / Н.А.Тюкавкина, И.А.Руленко, Ю.А.Колесник и др. // Материалы I Междунар. съезда «Акт. пробл. создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». - Выборг, 1997. - С.67-71.

11. Тарасова Е.А. Применение нового антиоксидантного препарата Диквертина в лечении больных ишемической болезнью сердца // Практическая Фитотерапия. - 1999. - №1. - С.37-41.

12. Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А. Дигидрокверцетин - новая антиоксидантная и биологически активная пищевая добавка // Вопр. питания. - 1997. - №6. - С.12-15.

13. Воскобойникова И.В., Геодакян С.В., Тюкавкина Н.А., Остроухова Л.А., Колесник Ю.А., Бабкин В.А. Количественное определение дигидрокверцетина методом ВЭЖХ // Фармация. - 1992. - №6. - С.74-75.

14. Храмова Е.П. Определение кверцетина и кемпферола в экстрактах пятилистника кустарникового методом ВЭЖХ // Мат-лы VII конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока-2004». - С.154.

15. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ. / Под ред. И.В.Березина. - М.: Мир, 1988. - 647 с.