лекарственное средство на основе d-циклосерина, препарат пролонгированного действия, содержащий наночастицы, способ его получения
Классы МПК: | A61K31/42 оксазолы A61K9/14 в виде частиц, например порошки A61P31/06 для лечения туберкулеза |
Автор(ы): | Северин Евгений Сергеевич (RU), Крюков Леонид Николаевич (RU), Зыкова Ирина Евгеньевна (RU), Барсегян Георгий Гайкович (RU), Воронцов Евгений Алексеевич (RU), Кузнецов Сергей Леонидович (RU), Помазкова Татьяна Анатольевна (RU), Гуманов Сергей Георгиевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2007-04-10 публикация патента:
10.03.2008 |
Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к новому поколению противомикробных препаратов регулируемого действия на основе циклосерина, содержащих наночастицы. Для получения этого препарата средство, содержащее смесь из D-циклосерина, PLGA 50/50, D-маннита, полисорбата 80 и диметилсульфоксида в определенном соотношении нагревают при 50-60°С до образования однородной прозрачной жидкости, которую далее охлаждают до комнатной температуры и после разбавления водой образующуюся суспензию, содержащую наночастицы размеров 3.0±0.5 нм (20% от общего количества частиц) и 200 нм (80% от общего количества частиц), используют по назначению. Изобретение обеспечивает получение препарата, обладающего высокой антимикробной активностью, пролонгированным действием, относительной безвредностью и низкой токсичностью. 3 н.п. ф-лы., 4 табл.
Формула изобретения
1. Лекарственное средство, обладающее антимикробным действием, характеризующееся тем, что оно содержит D-циклосерин, сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA 50/50), D-маннит, полисорбат 80, диметилсульфоксид (ДМСО) при следующем соотношении компонентов, мас.%:
D-Циклосерин | 0,75-2,50 |
PLGA 50/50 | 1,25-7,50 |
D-Маннит | 1,25-7,50 |
Полисорбат 80 | 0,5-1,0 |
Диметилсульфоксид | Остальное |
2. Препарат пролонгированного действия, характеризующийся тем, что содержит средство по п.1, которое при разбавлении его водой в соотношении 1:20 до 1:10 представляет собой суспензию наночастиц с размером частиц от 3 до 200 нм, в эффективной дозе.
3. Способ получения препарата по п.2, характеризующийся тем, что в емкость последовательно загружают D-циклосерин, PLGA 50/50, D- маннит, полисорбат 80 и ДМСО, смесь перемешивают и нагревают до 50-60°С в течение 15-20 мин до полного растворения твердой фазы, после чего охлаждают до комнатной температуры за 20-30 мин, при добавлении к смеси воды в соотношении 1:20 до 1:10 получают суспензию наночастиц с размером частиц от 3 до 200 нм.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к новому поколению противомикробных средств регулируемого действия на основе D-циклосерина.
Циклосерин - D-4-амино-3-изоксазолидинон - обладает широким спектром антибактериальной активности и назначается больным хроническими формами туберкулеза, у которых ранее применявшиеся основные препараты перестали оказывать эффект [1]. В этой связи циклосерин применяется как для лечения туберкулеза легких в активной форме и внелегочного туберкулеза (включая туберкулез почек), так и для лечения острых инфекций мочевыводящих путей, вызванных чувствительными штаммами грамположительных и грамотрицательных бактерий, в особенности видами Klebsiella/Enterobacter и Escherichia coli.
Вместе с тем при лечении циклосерином наблюдаются побочные явления, связанные с токсическим влиянием препарата на центральную нервную систему. Так, при приеме циклосерина более 500 мг в сутки у больных фиксировались судороги, сонливость, головная боль, тремор, головокружение, потеря памяти, психозы, возможно, с попытками самоубийства, изменения характера и повышенная раздражительность.
Уменьшение токсического действия циклосерина достигается назначением в период лечения либо глутаминовой кислоты (по 0,5 г 3-4 раза в день), либо внутримышечным введением натриевой соли аденозинтрифосфорной кислоты (по 1 мл 1% раствора ежедневно), либо внутримышечной инъекцией пиридоксина (1-2 мл 5% раствора в сутки). Запатентован оригинальный способ преодоления токсичности циклосерина путем его применения в желатиновых капсулах, содержащих 2-5 мас.% глутаминовой кислоты [2]. Это наиболее близкий аналог, который не дает возможности получить средство в виде наночастиц, которые дают пролонгированное действие.
Циклосерин быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта после приема внутрь, создавая обнаруживаемые уровни в плазме в течение одного часа. Он свободно распределяется по жидкостям и тканям организма. Около 66% дозы обнаруживается в неизменном виде в моче в течение 24 часов, 10% выводятся в течение следующих 48 часов. Около 35% метаболизируется, период полувыведения циклосерина колеблется в пределах 8-12 часов.
По своей молекулярной структуре циклосерин напоминает D-аланин и является мощным ингибитором аланинрацемазы. Он ингибирует также АТФ-зависимую D-аланил-D-аланин-синтетазу, необходимую для биосинтеза пептидоглюкана стенок бактериальной клетки, в частности Micobacterium tuberculosis [3-4].
Следует отметить, что в растворах циклосерин существует в нейтральной и диполярной формах, обладает амфотерными свойствами, рКа 4.4 и 7.3 [5], нестабилен в нейтральных и кислых водных средах [6].
Из анализа приведенных выше информационных материалов закономерно формулируется цель настоящего изобретения, а именно: создание лекарственного средства и препарата на основе циклосерина, уменьшающего токсичность активного вещества, обладающего пролонгацией действия при сохранении антимикробной активности стабильного при хранении и упрощение получения препарата.
Поставленная цель достигается использованием циклосерина в препарате, содержащем наночастицы, и базируется на современных достижениях фармакологии и медицины. Так, после проникновения M.tuberculosis в организм человека в качестве первой защитной реакции развивается фагоцитоз. Процесс взаимодействия легочных макрофагов с этими бактериями очень сложен [7]. При этом оптимизировать биораспределение противомикробного препарата можно лишь путем снижения его накопления в печени. Уменьшение эффективности фагоцитоза в печени достигается за счет применения наночастиц лекарственного препарата с неионогенными поверхностно-активными веществами (ПАВ), к примеру, полисорбата 80, что позволяет снизить накопление частиц в печени и увеличить время их циркуляции в организме («стелс-эффект») [8]. В этом плане значимые результаты были достигнуты при разработке наносомальной лекарственной формы рифампицина на полибутилцианоакрилате [9]. Имеются и другие данные о высокой эффективности наносомальных препаратов при лечении, в частности туберкулеза [10, 11]. За рубежом были разработаны противоонкологические препараты на основе наночастиц сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA) [12], которые под названиями декапептил, золадекс, сандостатин и соматулин разрешены к применению в медицинской практике Российской Федерации. Сополимер PLGA [50/50 Poly(DL-lactide-co-glycolide) (nominal)] нетоксичен и в организме человека подвергается биодеградации с образованием молочной и гликолевой кислот, катаболизм которых завершается образованием двуокиси углерода и воды [13].
Еще один аспект рассматриваемой проблемы связан с противопоказаниями применения циклосерина при наличии у больных тяжелой почечной недостаточности (клиренс креатинина менее 250 мл/мин) [1], которая преодолевается с помощью осмотических диуретиков, к примеру D-маннита [14].
Таким образом, из приведенных выше данных следует, что новое лекарственное средство и препарат на основе циклосерина потенциально должны содержать биодеградируемый полимер (PLGA), ПАВ (полисорбат 80) и D-маннит. В патентной литературе описано множество способов получения наночастиц, содержащих лекарственные или диагностические средства на биодеградируемых полимерах. К настоящему моменту эти методы суммированы в двух основополагающих патентах: эмульгирование с последующим лиофильным высушиванием [15] и механическое дробление в присутствии измельчающей среды [16]. При этом особое внимание обращает на себя тот факт, что для достижения эффективного всасывания препаратов в желудочно-кишечном тракте нужно, чтобы диаметр частиц был менее 500 нм [17].
Апробация известных методов нанотехнологии применительно к циклосерину не привела к успеху в силу его нестабильности в нейтральных и кислых водных средах [6]. В этой связи нами был разработан новый способ получения лекарственного препарата регулируемого действия на основе циклосерина, содержащего наночастицы. Предлагаемый способ базируется на упорядоченной структуре диметилсульфоксида (ДМСО), которая разрушается в интервале температур 40-60°С и возобновляется при 20-25°С [18]. При этом ДМСО способен к координационной сольватации с рядом органических и неорганических соединений, стабилизируя лабильные вещества [19]. Это в полной мере относится и к D-циклосерину, существующему в диполярной форме [5], и к PLGA, и к D-манниту. Дефицит электронной плотности на атоме углерода и нуклеофильность атома кислорода карбонильных групп PLGA способствуют образованию в жидком ДМСО агрегатов цепочечного строения. Получение упорядоченной матрицы становится определяющим событием при комплексном использовании ДМСО, циклосерина, PLGA и D-маннита в силу возникновения водородных связей за счет последнего ингредиента. Система стабилизированна и может быть использована по назначению. Необходимость применения неионогенных ПАВ (полисорбата 80) была рассмотрена ранее. При разведении полученного средства водой образуется устойчивая аполесцирующая суспензия, содержащая наночастицы размеров 3.0±0.5 нм (20% от общего количества частиц) и 200 нм (80% от общего количества частиц), которые могут эффективно всасываться в желудочно-кишечном тракте согласно вышеприведенным данным относительно размеров частиц [17].
Следует подчеркнуть, что экспериментальным путем были найдены такие соотношения циклосерина, PLGA, D-маннита, полисорбата 80 и ДМСО, при которых образуется средство жидкое, однородное, прозрачное и стабильное свыше года при комнатных условиях. При оценке стабильности качества образцов полученного затем препарата были использованы классические методы визуального контроля и рефрактометрического анализа. Рефрактометрия является интегральным методом оценки подлинности и чистоты веществ, позволяет определять концентрацию веществ в растворах и применяется в фармакопеи не одно десятилетие [20].
Обсуждая состав рассматриваемых средства и препарата, нельзя обойти вниманием вопрос о перспективах применения ДМСО в медицине. Так, внутримышечное введение больным алкогольной зависимостью дисульфирама в ДМСО приводит к длительному сенсибилизирующему эффекту [21]; при наружном применении ДМСО используется в комплексной терапии ревматоидного артрита, болезни Бехтерева, дискоидной красной волчанке, тромбофлебите, фурункулезе и экземе [22]; для лечения амилоидоза ДМСО применяют перорально до 100-200 мл 3-5% раствора в воде в сутки [23].
В целом, суммируя вышесказанное, впервые предложен лекарственный препарат регулируемого действия на основе циклосерина, содержащий наночастицы. Вначале получают раствор циклосерина, PLGA, D-маннита и полисорбата 80 в ДМСО. Затем аликвоту этой смеси разбавляют водой и получают устойчивую коллоидную систему, состоящую из наночастиц, и готовую к применению.
Оптимальный состав нового средства следующий, мас.%:
D-циклосерин | 0,75-2,50 |
PLGA 50/50 | 1,25-7,50 |
D-маннит | 1,25-7,50 |
Полисорбат 80 | 0,5-1,0 |
ДМСО | остальное |
При других соотношениях ингредиентов, как было установлено экспериментально, происходит либо потеря антимикробной активности, либо увеличение токсичности, либо нежелательные изменения в размерах полимерных частиц. Оптимальное разбавление средства в воде соответствует соотношению от 1:20 до 1:10, что может быть использовано для регулировки дозирования препарата в зависимости от индивидуальных особенностей больного.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Способ получения средства на основе D-циклосерина
В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником и термометром, при температуре 20-25°С последовательно загружают D-циклосерин, PLGA 50/50, D-маннит, полисорбат 80 и ДМСО. Смесь перемешивают и нагревают до 50-60°С в течение 15-20 мин до полного растворения твердой фазы, после чего охлаждают до комнатной температуры за 20-30 мин.
Состав граничных препаратов представлен в таблицах 1 и 2.
Таблица 1 | ||
Состав препаратов №1 | ||
№ пп | Наименование компонента | мас.% |
1. | D-Циклосерин | 0.75±0.05 |
2. | PLGA 50/50 | 7.50±0.10 |
3. | D-Маннит | 7.50±0.05 |
4. | Полисорбат 80 | 0.75±0.05 |
5. | Диметилсульфоксид | 83.50±0.20 |
Таблица 2 | ||
Состав препаратов №2 | ||
№ пп | Наименование компонента | мас.% |
1. | D-Циклосерин | 2.50±0.10 |
2. | PLGA 50/50 | 1.25±0.10 |
3. | D-Маннит | 1.25±0.10 |
4. | Полисорбат 80 | 0.80±0.05 |
5. | Диметилсульфоксид | 94.20±0.20 |
Указанные выше примеры средства представляют собой прозрачные однородные жидкости светло-желтого цвета, устойчивые при хранении свыше года. При добавлении к ним воды в соотношении 1:20-1:10 образуются устойчивые опалесцирующие суспензии, определение размеров частиц которых приведены в примере 2.
Пример 2. Анализ размеров частиц препаратов.
Определение размеров частиц и распределение частиц по фракциям осуществляли методом автокорреляционной спектроскопии на субмикронном лазерном спектрометре Coulter N4MD фирмы Coulter Electronics (Франция-США). Алгоритм измерений основан на программе CONTIN.
Образцы препаратов при разбавлении средства водой №1 и №2 циклосерина в количествах 3.5 мг вносили в кювету с дистиллированной водой (3 мл) и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 1 мин с помощью ультразвуковой ванны (Westwood Ultrasonics Ltd, Model 90S). Затем производили измерения. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3 | ||||||||
Результаты анализа размеров частиц образцов препаратов №1 и №2 | ||||||||
№№ композиции | Унимодальный анализ | Распределение частиц | Распределение размеров частиц по фракциям | |||||
Значение размера нм | Стандартное отклонение нм | Среднее значение нм | Стандартное отклонение нм | Коэффициент вариации % | Размер нм | Стандартное отклонение нм | Кол-во % | |
1 | 145 | 47 | 126 | 81 | 64 | 3.0 | 0.5 | 21 |
158 | 33 | 79 | ||||||
2 | ||||||||
148 | 31 | 133 | 94 | 71 | 3.0 | 0.5 | 23 | |
172 | 95 | 77 |
Пример 3. Элиминирование ингредиентов из препаратов.
Сравнительное исследование элимирования ингредиентов из препаратов осуществляли в условиях сменного диализа в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7.5) при комнатной температуре.
Для приготовления фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) (рН 7.5) применяли таблетки PBS Tablets phosphate buffered saline (AMRESCO). Одна таблетка на 100 мл дистиллированной воды.
В качестве диализных мешков использовали ленту Dialysis tubing, high retention. Size: 23 mm × 15 mm (Sigma-Aldrich). Предел исключения 12 кДа. Предварительно отрезки диализной ленты (10 см) кипятили в 0.001 М растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты в течение 1 ч.
Сосудами для проведения диализа служили мерные цилиндры емкостью 250 мл с крышками. Перемешивание диализной жидкости в ламинарном режиме осуществляли при помощи магнитных мешальников в тефлоновой оболочке и магнитной мешалки RH-KT/S (IKA®, Германия).
Измерение оптических плотностей растворов проводили на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония).
Для взвешивания использовали аналитические весы VIBRA (max/d 220/0.0001 г) (Япония).
Для отбора проб применяли пипетку (1-5 мл) и пластиковые наконечники (BIOHIT) (Финляндия).
Диализу были подвергнуты следующие препараты:
(1) ДМСО(1.33 г).
(2) Раствор в воде циклосерина (2.5 мг циклосерина +0.34 мл воды).
(3) Композиция №1 (0.3361 г).
В подготовленные диализные мешки (емкость около 5-6 мл) с помощью пипетки помещали перечисленные жидкие образцы. Мешки, загерметизированные с помощью зажимов, помещали в сосуды для диализа с 250 мл буферного раствора, закрепляли нитью, закрывали крышкой и включали перемешивание.
Периодически проводили отбор проб диализатов (по 3 мл) в стеклянные пробирки емкостью 10 мл. В пробах измеряли оптическую плотность при 207 и 226 нм против чистого раствора PBS. Затем пробы возвращали обратно в сосуды для диализа. Было проведено 2 смены диализатов. Продолжительность экспериментов составила 1-2 суток.
Установлено:
1. Элиминирование ДМСО из препарата (1) завершилось через 3 ч, а диализ циклосерина из препарата (2) прекратился через 2 ч.
2. Элиминирование циклосерина и ДМСО из препарата №1 не завершилось даже через сутки.
Таким образом, правомерно считать, что пролонгация действия циклосерина увеличится до 10 раз в случае применения препарата №1 в сравнении с индивидуальным циклосерином.
Однотипные данные получены и для препарата №2.
Пример 4. Оценка противомикробной активности препаратов
Определение противомикробной активности образцов препаратов в отношении тест-культур грамположительных, грамотрицательных и атипичных бактерий осуществляли методом серийных микроразведений в жидкой среде в соответствии с рекомендациями NCCLS/24/ при визуальной регистрации видимого роста. Динамическое измерение оптической плотности проводили с помощью многоканального спектрофотометра Bioscren (Labsystems) при длине волны 610 нм с интервалом 20 мин. Планшеты с бактериальными суспензиями инкубировали при 37°С в термостатируемом модуле прибора. Исходная концентрация микроорганизмов составляла 5×104 КОЕ/мл. Полученные результаты суммированы в таблице 4.
Таблица 4 | ||||
Антибактериальная активность образцов препаратов | ||||
Препарат | Концентрации препарата, % | Зоны задержки роста микроорганизмов, мм | ||
Staphylococus aureus АТСС 906 | Escherichia coli АТСС 25022 | Salmonella spp. (атипичная форма) | ||
ДМСО | 100 | 6.5 | 8 | 8 |
10 | - | 7 | 7 | |
5 | - | 7 | - | |
Циклосерин 2.5% р-р в ДМСО | 100 | 19 | 20 | 20 |
10 | - | 7 | 11 | |
5 | - | 7 | - | |
Препарат №1 | 100 | - | - | - |
10 | - | - | - | |
5 | - | - | - | |
Препарат №2 | 100 | 24 | 18 | 19 |
10 | - | 11 | 11 | |
5 | - | 10 | 7 |
Пример 5. Оценка токсичности препаратов.
Определение токсичности образцов препаратов осуществлялось согласно общепринятым методикам [25].
В исследованиях на 2-х видах животных обоего пола - мышах линии Balb-C и крысах Wistar установлено, что готовый к употреблению препарат (10% раствор средства №1 и №2) при однократном введении внутрь в дозе эквивалентной эффективной разовой терапевтической дозе циклосерина для человека (250 мг), а также в дозах, в 5 и 10 раз ее превосходящих, не производило токсического действия.
Источники информации
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. 4.2. / 12-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1993. - С.381-382.
2. Нестерук В.В., Сыров К.К. Лекарственное средство в виде желатиновой капсулы. / Патент РФ №2248205 С1. - 2003 г.
3. Gaie E.F., Cundliffe E., Reynolds P.E. et al. The Molecular Basis of Antibiotic Action. / Wiley. - New York. - 1972. - P.61-71.
4. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. М.: Мир, 1980. - С.223-225.
5. Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.5. Триптофан-Ятро-химия/Редкол.: Зефиров Н.С.(гд. ред.) и др. М.: Большая Российская энциклопедия, 1998. - С.740.
6. The Merck Jndex, 12 ed. (1996), N 2820, P.464.
7. Хоменко А.Г. Современные представления о патогенезе туберкулеза. // Русск. мед. журн. - 1998. - Т.6. - №17. - С.810-814.
8. Moghimi S.M., Hunter AC, Murrey J.C. Long-circulating and targetspecific nanoparticles: theory to practice. // Pharmacol. Rev. - 2001. - V.53. - P.283-318.
9. Оганесян Е.А., Будько А.П., Стукалов Ю.В. и др. Разработка и изучение наносомальной лекарственной формы рифампицина. // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - T.5 -. - Вып.8-9. - C. 15-19.
10. Khuller G.K., Pandey R. Sustained release drug delivery systems in management of tuberculosis. // J. Chest. Dis. Allied Sci. - 2003. - V.45. - P.229-230.
11. Pandey R., Zahoor A., Sharma S., Khuller G.K. Nanoparticle encapsulated antitubercular drugs as a potential oral drug delivery system against marine tuberculosis. // Tuberculosis. - 2003. - V.83. - N6. - P.373-378.
12. Ruth Duncan. Polymer conjugates as anticancer nanomedicines // Nature Reviews CancerYAOP, published online 10 August 2006; doi: 10.1038/nrc 1958
(www.nature.com/revuews/cancer).
13. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: Академкнига. - 2006. - 400 С.
14. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. Ч.1. / 12-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1993. - С.586-597.
15. Фанг Джна-Хва, Сингх Манмохан, О Хейган Дерек, Хора Маниндер. Композиции микрочастиц и способы их получения. / Патент РФ №227198 С.2. - 2005 г.
16. Сиджфрид К.Джун. Частицы, включающие плохо растворимое кристаллическое терапевтическое или диагностическое средство и способ их получения. / Патент РФ №2124886 С1. - 1999 г.
17. Вранккс Анри, Демустье Мартин, Делеер Мишель. Фармацевтический состав, содержащий нанокапсулы, и способ его получения. / Патент РФ №2145498 С1. - 1994 г.
18. Кукушкин Ю.Н. Диметилсульфоксид - важнейший апротонный растворитель. // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - №9. - С.54-59.
19. Оаэ С. Химия органических соединений серы. / Пер. с японск. М.: Мир, 1975 - С.223-278.
20. Государственная фармакопея СССР. Выпуск 1. Общие методы анализа. М.: Медицина, 1987. - С.24-30.
21. Собетов Б.Г., Собетова В.Б., Алексеевич Я.И., Озеров Б.Г., Меркулов СП. Способ получения инъекционной формы дисульфирама. / Патент РФ №2013090 С1. - 1994 г.
22. Димексид. Регистрационный номер РФ: PN 003411/01 от 22.04.2005.
23. Лечение амилоидоза. Московская многопрофильная клиника. htth://clinic.inventech.ru/urologv/urologv.0273shtml.
24. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Method for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved Standard M-7-A4./4 th ed. Villanova.
25. Принципы и методы оценки токсичности химических веществ. 4.1. Совместное издание программы ООН по окружающей среде и Всемирной организации здравоохранения, ВОЗ, Женева - 1981 г.
Класс A61K9/14 в виде частиц, например порошки
Класс A61P31/06 для лечения туберкулеза