способ определения водорастворимых витаминов

Формула изобретения

1. Способ определения водорастворимых витаминов, при котором осуществляют экстракцию определяемого витамина из навески анализируемого продукта, фильтрацию и центрифугирование экстракта, а также хромотографирование пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с разделением на колонке выбранного типа и спектрофотометрией на выбранной рабочей длине волны, отличающийся тем, что при хроматографировании применяют предколонку, дегазатор и термостат для колонки, в качестве навески используют измельченный анализируемый продукт, для определения различных водорастворимых витаминов в качестве элюента используют смесь метанола с ацетатным буферным раствором, имеющим водородный показатель рН выбранный из заранее заданного диапазона, причем соотношение метанола к ацетатному буферному раствору выбирают в зависимости от типа колонки, при этом выбранная рабочая длина волны для витаминов группы В составляет 275 нм, а для витамина С 295 нм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в состав ацетатного буферного раствора входят деионизованная вода, октилсульфонат натрия, уксусная кислота и триэтиламин.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что процентное соотношение деионизованной воды, уксусной кислоты, триэтиламина и октилсульфоната натрия составляет соответственно 98,13:1,00-1,15:0,13:0,64-1.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН буферного раствора выбирают из диапазона 2,8-3.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве навески используют измельченный анализируемый продукт с размером фракций не более 0,2 мм.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что фильтрацию осуществляют с использованием мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование осуществляют в течение 4-5 мин при 7000-8000 об/мин.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что промывание центрифугированием осуществляют один раз.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других биологических исследованиях при хроматографическом определении водорастворимых витаминов в кормах и поливитаминных смесях (блендах) для животных, а также в пищевых продуктах, витаминосодержащих лекарственных препаратах, биологических жидкостях (сыворотка крови) и других биологических объектах.

Известен из патента RU №2082170 (опубл. 1997.06.20) способ определения витамина B ₅ в биологическом материале, включающий выделение витамина B₅ из исследуемого материала путем кислотного гидролиза при 121°С, фильтрование гидролизата, хроматографирования на сорбенте с последующей спектрофотометрией, причем гидролиз проводят 12 н. H₂SO₄ в течение 30-60 мин, гидролизат депротеинизируют, в качестве сорбента используют Силасорб SPH С 18, а элюцию витамина B ₅ проводят смесью уксусная кислота: 25%-ный водный раствор триметиламина: вода при объемном соотношении 3: 2: 95. Измерения проводят с применением УФ-детектора на длине волны 260 нм. Объем пробы для анализа составляет 6 мкл, скорость подачи элюента на колонку 100 мкл/мин. Время, затраченное на анализ, включая гидролиз, составляет 1,5 ч. Недостатком данного способа является ограниченный круг анализируемых объектов (материалов) и определяемых в них витаминов.

Известен из патента РФ №2134883 (опубл. 1999.08.20) способ определения состава лекарственной формы, содержащей витамины, при котором разделение проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), причем хроматографирование проводят на Лихросорбе RP-18 в градиентном режиме с использованием метанола в фосфатном буфере при рН 7 в следующих соотношениях: 3%-ный метанол -1000 мкл, из которых 200 мкл идут на регенерацию колонки, затем 10, 30 и 40% по 400 мкл. Все водорастворимые витамины определяют при 260 нм, только кальция пантотенат (витамин В ₃) при 210 нм. Последовательность выхода пиков витаминов из колонки составляет: для кислоты аскорбиновой (витамин С)=1,33 мин, для кальция пантотената (витамина В₃ )=2,17 мин, пиридоксина гидрохлорида (витамина B ₆=7,67 мин, никотинамида (витамина РР)=10,78 мин, тиамина гидрохлорида (витамина B₁)=17,67 мин, рибофлавина (витамина В₂)=19,33 мин.

Недостатком является узкий диапазон определяемых концентраций и использование при анализе фосфатного буферного раствора, что ведет к увеличению вязкости подвижной фазы. Кроме того, фосфатный буферный раствор является прекрасной средой для быстрого размножения микроорганизмов, образованию их колоний, что отрицательно сказывается на работе аналитической колонки и существенно сокращает срок ее службы.

Наиболее близким по технической сущности является известный из ГОСТа Р 50929 - 96 («Премиксы. Методы определения витаминов группы В», УДК 636.085.3:006.354, Госстандарт России, ИПК Издательство стандартов, Москва, 1996 г.) способ определения методом ВЭЖХ витаминов группы В в премиксах, согласно которому осуществляют экстракцию витаминов B₁, В ₂ и B₅ из навески раствором соляной кислоты с последующим центрифугированием в течение 3 мин при 5000-6000 об/мин и определением их на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором. Для хроматографии используют колонку высотой 150 мм и диаметром 4 мм, заполненную сорбентом «Силасорб С-18» или «Сепарон С-18». Состав элюента для B ₁, B₂: 120 см³ ацетонитрил, 880 см³ дистиллированная вода, 2,5 см³ триэтиламин, 0,5 г октилсульфонат натрия, ортофосфорная кислота до рН 7,6. Скорость элюирования для B₁, В₂ 1,2 мл/мин, а рабочая длина волны 254 нм.

Состав элюента для B ₅: уксусная кислота, дистиллированная вода и триэтиламин в объемном соотношении 3:95:2. Скорость элюирования для B ₅ 80-100 мкл/мин, а рабочая длина волны 260 нм.

Диапазон определения содержания витаминов:

Для B ₁ 50-500 мг/кг

Для B₂ 100-2000 мг/кг

Для B₅ 200-4000 мг/кг

Данными способами предусмотрено определение узкого круга водорастворимых витаминов в незначительном диапазоне их содержания.

Кроме того, недостатком существующего ГОСТа является то, что для определения различных водорастворимых витаминов используют различные методы подготовки пробы к хроматографическому определению и различные условия хроматографирования.

В основу изобретения поставлена задача разработки способа эффективного определения содержания комплекса водорастворимых витаминов хроматографическим методом, обеспечивающим высокую чувствительность, точность, степень разделения и селективность определения при одновременном сокращении длительности анализа и подборе универсальных условий для его проведения. Задачей изобретения является также увеличение количества определяемых витаминов в пробе и расширение группы анализируемых объектов.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения водорастворимых витаминов, при котором осуществляют экстракцию определяемого витамина из навески анализируемого продукта, фильтрацию и центрифугирование экстракта, а также хроматографирование пробы методом высокоэффективной жидкостной хромотографии с разделением на колонке выбранного типа и спектрофотометрией на выбранной рабочей длине волны, новым является то, что используют метод ион-парной обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хромотографии, при хроматографировании применяют предколонку, дегазатор и термостат для колонки, в качестве навески используют измельченный анализируемый продукт, для определения различных водорастворимых витаминов в качестве элюента используют смесь метанола с ацетатным буферным раствором, имеющим водородный показатель рН, выбранный из заранее заданного диапазона, причем соотношение метанола и ацетатного буферного раствора выбирают в зависимости от типа колонки, при этом выбранная рабочая длина волны для витаминов группы В составляет 275 нм, а для витамина С 295 нм.

Целесообразно, чтобы в состав ацетатного буферного раствора входили деионизованная вода, уксусная кислота, триэтиламин и октилсульфонат натрия предпочтительно в процентном соотношении соответственно 98,13:1,00-1,15:0,13:0,64-1

Желательно рН ацетатного буферного раствора выбирать из диапазона 2,8-3.

Целесообразно анализируемый продукт измельчать и отбирать для навески фракции с размером не более 0,2 мм.

Предпочтительно экстракцию проводить при нагревании до температуры 70-80°С с последующим охлаждением на встряхивающем устройстве.

Желательно центрифугирование осуществлять в течение 4-5 мин при 7000-8000 об/мин, причем возможно осуществлять однократное промывание центрифугированием.

Целесообразно фильтрацию осуществлять с использованием мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.

Предпочтительно в качестве колонки использовать колонку РЕ reduced activity С-8, длиной 83 мм, диаметром 4,6 мм, заполненную октодецилсиланом зернением 3 мкм, причем объемное соотношение метанола и буферного раствора составляет соответственно 15:85, а скорость элюирования составляет 1,5 мл/мин.

Целесообразно в качестве колонки использовать колонку РЕ Pecosphere 3CR С8, длиной 83 мм, диаметром 4,6 мм, заполненную monofunctional base deactivated 3 мкм 80Å; при этом объемное соотношение метанола и буферного раствора составляет соответственно 16:84, а скорость элюирования составляет 1,5 мл/мин с увеличением после 8 минуты до 2 мл/мин.

Возможно в качестве анализируемых продуктов выбирать продукты из ряда, содержащего премиксы, комбикорма, поливитаминные смеси, лекарственные витаминосодержащие препараты, биологические материалы, пищевые продукты.

Целесообразно для снижения вязкости подвижной фазы и ускорения сорбционных процессов на аналитической колонке поддерживать температуру термостата приблизительно 35°С.

Целесообразно в качестве предколонки использовать Scavenger C18, длиной 33 мм, диаметром 4,6 мм и зернением 10 мкм.

Нижеследующие примеры иллюстрируют осуществление данного изобретения.

Пример 1.

Для приготовления стандартных растворов витаминов при анализе используют следующие витамины:

Тиамина гидрохлорид (витамин B ₁), Sigma-Aldrich CAS.No. 67-03-8;

Рибофлавин (витамин 82), Sigma-Aldrich CAS. No. 83-88-5;

Никотиновая кислота или никотинамид (витамин B₅), Sigma-Aldrich CAS. No. 59-67-6,98-92-0;

Пиридоксина гидрохлорид (витамин B₆), Sigma-Aldrich CAS. No. 58-56-0;

Фолиевая кислота (витамин B₉), Sigma-Aldrich CAS. No. 75708-92-8.

Цианокобаламин (витамин B ₁₂), Sigma-Aldrich CAS. No. 68-19-9.

Аскорбиновая кислота (витамин С), Sigma-Aldrich CAS. No. 50-81-7.

Для приготовления стандартных растворов витаминов при анализе комбикормов и премиксов навески витаминов (B₁ - 0,1 г, В₂ - 0,25 г, B₅ - 1 г, B₆ - 0,2 г) с точностью 0,0005 г помещают в мерную колбу на 100 мл, а затем добавляют деионизованную воду удельным сопротивлением 18 МОм/см³ и после растворения доводят той же водой до метки. Каждый раствор готовят в отдельной мерной колбе (соответственно растворы №1, 2, 3,4). Из полученных растворов готовят рабочий стандартный раствор витаминов. Из каждой колбы берут аликвоту объемом 1 мл и переносят в отдельную колбу на 100 мл и доводят деионизованной водой до метки. 1 мл полученного раствора содержит 0,01 мг витамина B₁, 0,025 мг витамина В ₂, 0,1 мг витамина В₅ и 0,02 мг витамина B₆ (раствор №5).

Витамин В ₉ готовят в отдельной колбе. Берут навеску 0,05 г с точностью 0,0005 г, переносят в мерную колбу на 100 мл и приливают 0,1 М раствор гидрокарбоната натрия в воде, после растворения доводят тем же раствором до метки (раствор №6). Из полученного раствора аликвоту объемом 1 мл переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки раствором гидрокарбоната натрия. 1 мл полученного рабочего стандартного раствора содержит 0,005 мг/мл фолиевой кислоты (раствор №7).

Для приготовления стандартных растворов витаминов при анализе поливитаминных смесей (блендов) из основного раствора №1 берут аликвоту 5 мл, из раствора №2 - 8 мл, №3 - 5 мл и №4 - 5 мл. Переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки деионизованной водой. 1 мл полученного рабочего стандартного раствора содержит 0,05 мг витамина B₁, 0,2 мг витамина В₂, 0,5 мг витамина B ₅ и 0,1 мг витамина B₆ (раствор №8).

Для приготовления рабочего раствора фолиевой кислоты из раствора №6 в мерную колбу на 100 мл переносят аликвоту объемом 4 мл и доводят до метки 0,1 М раствором гидрокарбоната натрия в воде (раствор №9).

Основные растворы (№1, 2, 3, 4 и 6) хранят в холодильнике не более 2 недель. Рабочие стандартные растворы (№5,7,8 и 9) готовят в день проведения анализа.

Количество взятого образца для анализа и конечный фактор разбавления зависят от теоретического содержания витаминов и от природы образца. Поэтому навеску образца подбирают исходя из рецептуры его приготовления, поскольку содержание витаминов в комбикормах, премиксах и витаминных концентратах находится в очень широком концентрационном диапазоне.

Точную массу рассчитывают таким образом, чтобы значение концентраций витаминов в конечном экстракте было как можно ближе к значению их концентраций в стандартных растворах. Приблизительная масса навески для комбикорма и растительного премикса составляет 1 г, для поливитаминных блендов - 0,1 г.

Анализируемый продукт измельчают в роторной мельнице Pulverisette 14 до пылеобразного состояния и взвешивают навеску с погрешностью не более 0,0005 г. Для взвешивания берут фракцию, прошедшую через сито 0,2 мм.

Экстракцию витаминов B₁ B ₂ В₅ B₆ ведут 15 мл 0,01 моль/дм³ HCl.

Экстракциию витамина В₉ ведут 15 мл 0,1 М раствором гидрокарбоната натрия в воде.

Экстрагирование проводят в конической колбе на 100 мл, разогрев ее до 70-80°С и последующим охлаждением в течение15 минут на перемешивающем устройстве модель 6410 М «Экрос» (возможно применение магнитной мешалки).

Центрифугирование осуществляют на аппарате центрифуга ОПН-8 в течение 4-5 мин при 7000-8000 об/мин, после чего центрифугат сливают в мерную колбу на 25 мл. Промывание центрифугированием проводят 1 раз 10 мл экстрагента. Объединенный центрифугат доводят до метки деионизованной водой и фильтруют для очищения от механических примесей.

При выполнении качественного анализа продукта возможно осуществление экстракции витамина В₉ в условиях экстракции витаминов B₁ В ₂ B₅ B₆ и совместного их центрифугирования.

Хроматографический анализ проводят методом ион-парной обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хромотографии в следующих условиях.

Ацетатный буферный раствор подвижной фазы для элюирования готовят на основе деионизованной воды удельным сопротивлением 18 МОм/см³ , полученной на аппарате для получения деионизованной воды Simplisity (Millipore). В мерную колбу на 1000 мл вносят навеску октилсульфоната натрия массой 0,432 г, добавляют 950 мл деионизованной воды, перемешивают, добавляют 10 мл уксусной кислоты и 1,32 мл триэтиламина и затем измеряют рН раствора. Если значение рН выходит за рамки диапазона 2,8-3,0, то доведение осуществляют уксусной кислотой и доливают деионизованную воду до V=1000 мл. Полученный раствор (раствор №10) фильтруют с помощью аппарата для фильтрования Supelco через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Хроматограф жидкостный Series 200 (Perkin Elmer) с фотометрическим детектором (диапазон длин волн от 190 до 700 нм, точность установки длины волны ±1 нм, относительное СКО выходного сигнала - не более 1,5%) и автодозатором (точность не хуже 0,5% СКО по площади пика). Колонку для хроматографии (РЕ reduced activity C-8, длина 83 мм, диаметр 4,6 мм), заполненную октодецилсиланом зернением 3 мкм, размещают в термостате.

Для защиты аналитической колонки от макрочастиц, содержащихся в пробах сложного многокомпонентного состава, используют предколонку Scavenger C18, длиной 33 мм, диаметром 4,6 мм, зернением 10 мкм

Подвижная фаза (элюент) - метанол марки HPLC grade (для ВЭЖХ) с раствором №10 в объемном соотношении 15:85.

Для обеспечения стабильности нулевой линии детектора и продления срока службы аналитической колонки осуществляют высокую степень дегазации элюента вакуумным дегазатором Series 200 (Perkin Elmer).

Перед хроматографированием пропускают через колонку несколько объемов подвижной фазы для установления равновесия в хроматографической колонке (устойчивая базовая линия). Для насыщения колонки выполняют несколько измерений стандартного рабочего раствора витаминов до получения воспроизводимых площадей пиков и времен удерживания анализируемых витаминов. Затем хроматографируют раствор анализируемого продукта в тех же условиях, при этом:

рабочая длина волны на УФ детекторе 275 нм для B ₁ В₂ В₅ B ₆ B₉;

скорость элюирования - 1,5 мл/мин;

температура термостата колонки - 35°С;

объем инжектируемого экстракта - 10 мкл.

Время проведения хроматографического определения составляет 10 мин.

Хроматограмма экстракта премикса представлена на фиг.1.

Хроматограммы премикса П-5-1-2 (для птиц) представлены на фиг.2 и фиг.3.

Возможно приготовление стандартных растворов и проб с использованием дистиллированный воды, но для большего сродства инжектируемой пробы и элюента целесообразно использовать для всех растворов деионизованную воду.

С целью оптимизации условий анализа проводились специальные исследования влияния температуры проведения экстракции, что составило (70-80°С); времени экстракции, что составило 10-20 минут; времени центрифугирования, что составило 4-5 минут; термостатирования, что составило 34-36°С, а также количества промываний остатка после центрифугирования, скорости центрифугирования, рН эюента, процентного соотношения его компонентов, количества ион-парного реагента, влияющих на полноту извлечения.

Процентное соотношение компонентов:

деионизованная вода: уксусная кислота: триэтиламин: октилсульфонат натрия составляет соответственно 98,13:1,00-1,15: 0,13:0,64-1.

Промывание остатка после центрифугирования достаточно осуществлять один раз.

При обработке результатов построение калибровочного графика по рабочим стандартным растворам осуществляли с использованием программного обеспечения «TotalChrom Workstation», а проверку выполняли методом добавок.

Для хроматографических измерений использовали метод сравнения площадей пиков для анализируемой пробы и стандартного раствора. Содержание водорастворимых витаминов X_i, мг/г, рассчитывают по формуле:

C_S - концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/мл,

V _P - объем экстракта премикса, мл,

S _x, S_S - площади пиков витаминов на хроматограмме пробы и стандарта, mAU·c,

m - масса навески продукта, г.

За результат измерения содержания витамина в пробе принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений (X₁ и Х ₂).

Пример 2.

Условия подготовки пробы соответствовали условиям подготовки пробы, описанной в примере 1.

Для хромотографии использовалась колонка РЕ Pecosphere 3CR С8, длиной 83 мм, диаметром 4,6 мм, monofunctional base deactivated 3 мкм 80Å;

Объем инжектируемого экстракта - 10 мкл;

Ацетатный буферный раствор:

0,432 г октилсульфоната натрия,

1000 мл деионизованной воды,

10 мл уксусной кислоты,

1,33 мл триэтиламина,

рН раствора 3,0.

Подвижная фаза (элюент): метанол с ацетатным буферным раствором в объемном соотношении 16:84.

Рабочая длина волны на УФ детекторе 275 нм для B ₁ B₂ B₅ B ₆ B₉.

Скорость элюирования - 1,5 мл/мин, после 8 минуты скачок до 2 мл/мин;

Температура термостата колонки 35°С;

Время выхода хроматограммы составило 10 мин.

Хроматограмма экстракта премикса представлена на фиг.4

Пример 3.

В условиях подготовки пробы (экстракция соляной кислотой), хроматографирования и детектирования сигнала, аналогичных примеру 1 (или 2), анализировали содержание в исследуемом образце витамина В₁₂. Рабочая длина волны на УФ детекторе 275 нм.

Хроматограмма витаминной смеси «Содровит бленд З» представлена на фиг.5.

Пример 4.

В условиях хроматографического разделения, аналогичных примеру 1, выполняли на рабочей длине волны 295 нм качественный анализ содержания витамина С в лекарственных формах, биологических пробах и пищевых продуктах.

На фиг.6 представлена хроматограмма аскорутина.

На фиг.7 представлена хроматограмма таблетки аскорбиновой кислоты с глюкозой.

На фиг.8 представлена хроматограмма профильтрованной сыворотки крови свиньи.

На фиг.9 представлена хроматограмма детского питания «Пюре яблочно-персиковое».

На фиг.10 представлена хроматограмма фруктового сока J7 orang.

Полученные результаты сопоставимы с соответствующими данными, указанными в сертификатах качества или аннотациях.

Пример 5.

В условиях хроматографического разделения, аналогичных примеру 1, проводили анализ витаминного препарата Декамевит. Хроматограмма для витаминов группы В (рабочая длина волны 275 нм) представлена на фиг 11. Хроматограмма для витамина С (рабочая длина волны 295 нм) представлена на фиг.12.

Представленные в примерах хроматограммы иллюстрируют полное разделение компонентов, что касается анализируемых проб лекарственных витаминосодержащих препаратов, и достаточное, что касается проб пищевых продуктов и сложных по составу белковых биологических проб.

Диапазон определяемых витаминов согласно предлагаемому способу представлен в таблице.

B1	(3,0-100000) мг/кг
В 2	(1,5-30000) мг/кг
В5	(1,5-200000) мг/кг
B6	(1,25-100000) мг/кг
В 9	(1,5-20000) мг/кг
B12	(2,0-10000) мг/кг
C	(1,5-200000) мг/кг

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет получить больше информации о составе интересующей сложной смеси, расширить диапазон содержаний определяемых витаминов, устраняет необходимость анализа витаминов различными методами, что требует дополнительных временных, трудовых и материальных затрат.

Подбор универсальных условий позволяет проводить хроматографическое разделение в узких временных рамках и сокращает продолжительность всего анализа в целом.

Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, селективностью определения, точностью и воспроизводимостью, позволяет достигнуть высокой степени извлечения, учитывая сложность состава анализируемых объектов.

Использование способа позволяет увеличить срок службы аналитических колонок, сокращая тем самым расходы на амортизацию дорогостоящего хроматографического оборудования.