способ получения сухого экстракта из травы кориандра посевного, обладающего антистрессорным, седативным, ноотропным и гипотензивным действием

Формула изобретения

Способ получения антистрессорного, седативного, гипотензивного и ноотропного средства из растительного сырья, отличающийся тем, что экстракцию проводят 40%-ным спиртом этиловым и в качестве исходного сырья используют траву растения кориандра посевного, сырье измельчают и экстрагируют трижды 40%-ным этиловым спиртом при температуре кипения и постоянном перемешивании, соотношение сырье - экстрагент 1:5, в течение 1 ч при каждом экстрагировании, далее извлечения объединяют, фильтруют в горячем виде, спирт из фракции удаляют под вакуумом и полученный водный остаток выдерживают при температуре не выше +10°С в течение не менее 5 ч, после отстаивания отделяют смолистые вещества декантацией-фильтрацией, очищенное водное извлечение сушат и получают целевой продукт.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к фармации и медицинской промышленности и касается получения сухого экстракта из травы кориандра посевного, обладающего выраженным антистрессорным, седативным, ноотропным и гипотензивным эффектами.

Известно, что отвар из травы кориандра в народной медицине применяют при неврастении. Близкую активность проявляют экстракты валерианы, поэтому их применяют в качестве успокаивающих средств при повышенной нервной возбудимости и сердечно-сосудистых неврозах. Однако их антистрессорная активность выражена слабее, чем седативная.

Известны способы получения экстрактов валерианы лекарственной. Так, в способе, описанном (а.с. №187234, кл. А61К 35/78), для получения настойки из корней валерианы, последние перед экстракцией обрабатывают раствором бисульфита натрия.

По другому способу (Заявка ФРГ №2230626, кл. А61К 35/78) препарат валерианы получают, экстрагируя корни низшими липофильными растворителями, с последующим удалением растворителя в вакууме и растворением остатка в многоатомном спирте, жировом или эфирном масле или в их смесях в соотношении сырья и готового экстракта 1:1.

В способе получения растворимых экстрактов (Заявка ФРГ N 3715070, кл. А61К 35/78) к 1 т корня валерианы очищенной и измельченной добавляют 1800 л воды, экстрагируют при нагревании, осадок отфильтровывают и получают 1400 л экстракта продукта, который сушат известным способом.

В способе получения фармакологически активного средства (Заявка Японии №1-246211, кл. А61К 7/06) растительное сырье - смесь из 3-х растений, в том числе и корней валерианы, обрабатывают растворимым в воде органическим растворителем, например, метанолом, этанолом, пропанолом, бутанолом, ацетоном и другими или их водными растворами и далее получают лечебное средство.

Все перечисленные способы имеют следующие существенные недостатки:

- ни один из перечисленных средств не обладает одновременно и антистрессорным, и ноотропным, и гипотензивным действием;

- применение в качестве экстрагентов липофильных органических растворителей;

- многоатомного спирта глицерина;

- токсических органических растворителей - метанола, бутанола и др.;

- необходимость регенерации указанных растворителей с учетом экологических требований;

- значительные энергозатраты, связанные с измельчением.

Наиболее близким аналогом и прототипом для заявляемого объекта является способ получения сухого экстракта из валерианы лекарственной, обладающего седативным действием (Патент RU N 2098115). Данный способ заключается в экстракции сырья 65-75%-ным водным этанолом при соотношении сырье - экстрагент (1:4-6) фильтрационным способом, с последующим упариванием, отделением осадка и сушкой целевого продукта.

Новизна предлагаемого изобретения заключается в том, что в его основу поставлена техническая задача получения сухого экстракта из травы кориандра посевного, характеризующегося выраженной антистрессорной, седативной, ноотропной и гипотензивной активностью. Важно отметить, что для препаратов валерианы ноотропный эффект не характерен. Другим отличительным признаком заявляемого объекта является та особенность, что для экстракции используется 40% водный этанол, что позволяет максимально извлечь действующие вещества, обеспечивающие перечисленные выше фармакологические свойства. Критерием новизны является также тот факт, что для достижения поставленной цели используется надземная часть пищевого растения кориандра посевного. Очевидная новизна предлагаемого способа свидетельствует о творческом характере решения, т.е. говорит о соответствии предлагаемого решения требованию "необычности" и "первичности".

Технический результат, получаемый в ходе решения поставленной задачи, выражается: в использовании нового вида сырья - травы кориандра посевного, относящегося к широко применяемым пищевым растениям, а также, в отличие от плодов, практически не используемого в научной медицине.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления заявляемого изобретения, состоят в следующем: траву, собранную во время цветения в июне - августе, сушат в тени, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 5 мм. Далее сырье экстрагируют 40% водным этанолом в колбе при температуре кипения и постоянном перемешивании (кратность экстракции - 3, время - 1 ч от начала кипения при соотношении сырье - экстрагент 1:5). Полученные извлечения фильтруют в горячем виде и соответственно объединяют. Спиртово-водное извлечение выпаривают в вакууме до удаления спирта. Полученный концентрат выдерживают при температуре не выше +10°С в течение не менее 5 часов. После отстаивания отделяют смолистые липофильные вещества с помощью декантации и фильтрации. Очищенную водную фракцию сушат и получают целевой продукт.

Пример. 20,0 кг высушенной и измельченной травы кориандра посевного (размер частиц не более 5 мм) загружают в экстрактор мацерационного типа плотным слоем. Сырье в экстракторе при температуре 70°С обрабатывают при перемешивании 40%-ным водным этиловым спиртом в течение 2 часов. Процесс экстрагирования ведут при соотношении сырье - экстрагент 1:4, кратность экстракции - 3. Отбор экстракта осуществляют путем вакуумной фильтрации со средней скоростью около 15 л/ч.

Полученный экстракт упаривают при температуре 70-80°С и остаточном давлении в аппарате 0,1-0,2 кгс/см ² до полного удаления из экстракта этанола и с получением около 25 л концентрата.

Концентрат переносят в емкость-отстойник, которую закрывают крышкой и помещают в холодильную камеру, где выдерживают в течение 5 ч при температуре +10°С.

Отделяющаяся от маточного раствора смолистая масса, содержащая хлорофилл, каротиноиды и другие липофильные вещества, локализуется у поверхности раствора или по стенкам отстойника. Ее отделяют декантацией и далее маточный раствор фильтруют на нутч-фильтре через слои бязи и бумаги.

Полученный водный фильтрат высушивают на распылительной сушке типа РЛС-10. Выход целевого продукта 23,5%.

Полученный целевой продукт по качеству стандартизуется методом количественной спектрофотометрии по содержанию в нем суммы флавоноидов и кумаринов, а также другими качественным показателями.

В результате реализации предлагаемого способа используют новый вид растительного сырья траву кориандра посевного, которую ранее не использовали. Это способствует расширению сырьевой базы и комплексному использованию ценного растительного сырья кориандра.

Изучение фармакологической активности полученного экстракта

Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Wistar массой 200-220 г, выращенных в виварии Пятигорской государственной фармацевтической академии. Животные содержались в стационарных условиях вивария, получали стандартный корм и воду без ограничения. В эксперименте участвовали опытная и контрольная группы [Методические рекомендации по оценке качества лабораторных животных для медико-биологических исследований (составители А.М.Беспалов, Р.Ф.Кузина) - М., 1985. - 63 с.].

Для создания стрессовой ситуации использовали модель хронической адреналиновой интоксикации [Ю.В.Быць, А.В.Атаман. Энергетический обмен в артериях и венах в условиях моделирования адреналиновых поражений сосудистой стенки. // Патологическая физиология. - 1989. №3, с.63-65]. Раствор адреналина гидрохлорида крысам вводили внутрибрюшинно один раз в сутки в дозе 100 мг/кг в течение двух месяцев.

После 2-недельного введения адреналина опытной группе стали вводить водный раствор сухого экстракта травы кориандра в дозе 50 мг/кг перорально один раз в сутки в течение 45 дней. Контрольной группе в эквивалентном объеме вводили изотонический раствор натрия хлорида 0,9%.

На 14, 30 и 60 день эксперимента фиксировали неврологический статус животных по показателям: поведение животных в "Открытом поле" (ОП) [А.Л.Маркель. Факторный анализ поведения крыс в тесте открытого поля. // Журн. высш. нерв. деятельности им. Павлова. - 1988. - Т.XXXIII. - Вып.5, с.855-863, К.В.Судаков. Нормальная физиология. - М.: МИА, 1999, с.193-197, С.А.Титов. Роль ориестированного и оборонительного компонентов в поведении белых крыс в условиях "открытого поля". // Журн. высш. нерв. деятельности им. Павлова, - 1980. - Т.ХХХ. - Вып.4, с.704-708] и оценивали когнитивные функции по тесту условной реакции пассивного избегания (УРПИ) [Я.Буреш. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М.: Высшая школа, 1999, 399 с.].

Условный рефлекс пассивного избегания вырабатывался ударом тока 40 В. Для чего животных помещали в центр квадратного ящика. К ящику был приставлен маленький темный отсек, пол в котором был сделан из металлических пластинок, подсоединенных к генератору тока. После того как испытуемые переходили в меньшее помещение, их ударяли током. Таким путем вырабатывался условный рефлекс на вход в помещение, напоминающее нору, время (с) входа фиксировалась секундомером.

На 60-й день эксперимента фиксировали изменение времени сна под действием нембуталового наркоза в дозе 25 мг/кг [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: 2000. - 398 с., Сернов Л.Н., Гацура В.В. Элементы экспериментальной фармакологии. - М.: 2000. - 352 с.].

Опыты по изучению влияния данного экстракта на сердечно-сосудистую систему проводили на двух других группах животных, которым экстракт вводили перорально в течение месяца в дозе 20 мк/кг, а контрольной группе вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Системное артериальное давление (САД) определяли в сонной артерии с помощью ртутного манометра на наркотизированных животных (уретан-хлоралоза 500 мг/кг и 50 мг/кг соответственно).

Исследование острой токсичности по определению LD₅₀ проводили по методу Кербера на мышах.

Полученные в результате экспериментов данные обрабатывали статистически. Результаты в таблицах представлены в виде средних величин с доверительным интервалом (М±m) или среднеквадратичным отклонением. Достоверность полученных результатов определяли при помощи t-критерия Стьюдента [Поляков И.В., Соколова Н.С. Практическое пособие по медицинской статистике. - Л.: Медицина, 1975. - 152 с. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000. - 398 с.].

Результаты и выводы.

Проведенные исследования острой токсичности позволяют отнести данное извлечение к 4-му классу опасности по ГОСТу 12.1.007-76 или к практически нетоксичным веществам по классификации Сидорова К.К. (1973) [Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения // Токсикология новых промышленных веществ - М.: Медицина, 1973. - 475 с., К.К.Сидоров. О гармонизации отечественных и международных классификаций острой токсичности химических соединений / Токсикологический вестник. - №6 (ноябрь-декабрь) 2004. - с.3.]. Рассчитанная величина LD₅₀ в наших опытах составила 5166,7±167,9 мг/кг [Макарова Л.М., Нерсесян З.М. К вопросу создания лекарственных средств на основе кориандра посевного. // Международный молодежный медицинский конгресс. Санкт-Петербург, 2005, с.154-155].

В опытной группе животных без лечения нарушение когнитивных функций было зафиксировано на четвертой неделе опыта, которое сохранилось до конца эксперимента. Следовательно, курсовое введение адреналина гидрохлорида приводит к нарушению когнитивных функций (таблица №1).

У животных опытной группы выработанный условный рефлекс прочно сохраняется на протяжении всего эксперимента. О чем свидетельствует отсутствие входа животных в темный отсек. Полученные данные представлены в таблице №1.

Динамика изменения показателей, характеризующих поведение в "открытом поле", показывает, что через месяц эксперимента у контрольной группы животных снизилась двигательная (в среднем на 66,2%) и исследовательская активность (на 53,3%). Нарушение поведенческих реакций сохраняется в течение всего времени эксперимента (таблица №2 и фиг. 1 и 2).

В опытной группе животных к концу эксперимента также наблюдали снижение показателей двигательной активности, о чем свидетельствует уменьшение числа пересеченных квадратов (таблица №3 и фиг.2). Следует отметить, что в опытной группе после истечения двух месяцев увеличивается время нахождения животных в центре арены. Данная тенденция говорит о снижении уровня тревожности.

При анализе времени сна установлено, что применение экстракта существенным образом препятствует пролонгации сна под действием наркоза. Полученные данные представлены в таблице №4.

Из таблицы видно, что у животных опытной группы время сна намного меньше, чем у контрольной группы, и приближается к времени сна интактных животных. Латентное время засыпания животных примерно одинаково.

Также установлено, что курсовое введение исследуемого экстракта приводит к снижению САД. В среднем на 30 день эксперимента САД составляет 98,3±5,7 мм рт.ст. [Нерсесян З.М., Макарова Л.М. Экспериментальное изучение влияния курсового введения экстрактов травы кориандра посевного на мозговой кровоток и системное артериальное давление // Молодежная наука и современность. Часть II. Курск, - 2005, с.118-119].

Таким образом, проведенное фармакологическое исследование свидетельствует о том, что сухой экстракт из травы кориандра обладает вышеупомянутыми фармакологическими эффектами.

Для детального изучения компонентного состава фенольных соединений полученного извлечения мы применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для анализа методом ВЭЖХ - около 0,1 г (точная навеска) экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 20 мл воды дистиллированной и помещали в ультразвуковую баню и перемешивали при температуре 50°С в течение 15 минут. Объем раствора доводили до метки тем же растворителем (раствор А), 1 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки подвижной фазой (исследуемый раствор).

Условия хроматографирования

Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "GILSON" (Франция) (модель 305) с ручным инжектором RHEODYNE-7125 (USA) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования, используя программу "МультиХром" для "Windows". В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6×250 мм PLATINUM EPS С18 100, размер частиц 5 мкм.

В качестве подвижной фазы метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная, в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,5 мл/мин. Продолжительность анализа 170 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ детектора "GILSON" UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм.

Параллельно готовили серию 0,05% растворов сравнения в 70% спирте этиловом. По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали. Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления времен удерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы, со временами удерживания стандартных растворов (РСО). Количественное определение идентифицированных веществ в исследуемом образце проводили по площади пиков, используя метод внутренней нормализации.

В результате проведенных исследований в полученной нами 40% фракции травы кориандра посевного было выделено 43 веществ, из которых идентифицировано 20 соединение полифенольной природы, которые в основном представлены флавоноидами, кумаринами и производными фенолкарбоновых и органических кислот. Было установлено, что из веществ кумариновой природы в наибольшем количестве содержатся дикумарин, 4-оксикумарин, скополетин, умбеллиферон, эскулин и эскулетин; из флавоноидных соединений - ориентин, витексин, диосмин, хризоэриол, гесперидин; из производных фенолкарбоновых кислот преобладает феруловая и галловая кислоты. Полученные результаты представлены в таблице №5.

Следует отметить, что преобладающим компонентом является галловая кислота. Такие соединения как галловая кислота, арбутин, эскулин, эскулетин, диосмин, салициловая кислота, ориентин, дигидрокверцетин, скополетин, лютеолин-7-гликозид, гиперозид, гесперидин, 4-оксикумарин, умбеллиферон, вицетин, катехин, лютеолин и апигенин впервые идентифицированы в траве кориандра посевного.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что сухое извлечение из травы кориандра посевного содержит широкий комплекс биологически активных веществ полифенольной природы. Полученные данные свидетельствуют о значимости данного объекта не только с химической точки зрения, но и с фармакологической, так как служат материальной базой, доказывающей эффективность данного извлечения в качестве профилактического средства при различных заболеваниях.

Таблица №1
Латентное время входа животных в темный отсек
Группа/время	Контрольная группа, с	Опытная группа, с
Исходные данные	26,1±12,1	32,9±7,04
Спустя 14 дней	-	-
Спустя 4 недели	58,2±6,3*	-
Спустя 8 недель	45,0±1,3*	-
Примечание: *достоверные отличия (р>0,05) относительно исходных данных, "-" обозначение отсутствия захода животных в темный отсек

Таблица №2
Показатели поведения контрольной группы в "открытом поле"
Показатели/время исслед.	Исходные данные	Спустя 4 недели	Спустя 8 недель
1.Кол-во пересеч. квадратов	57,0±8,5	27,3±4,8*	6,2±1,6*
2. Верхние стойки	11,2±2,3*	6,1±1,3	0,5±0,1*
3.Груминг	2,5±0,7	1,4±0,3*	0,3±0,1*
4. Столбики	1,9±0,8*	0,72±0,3*	1,0±0,1
5. Заглядывания в отверстия	0,3±0,13	-	-
Примечание: * достоверные отличия (р>0,05) относительно исходных данных, "-" обозначено отсутствие заглядываний

Таблица №3
Показатели поведения опытной группы в "открытом поле"
Показатели/время	Исходные данные	Спустя 4 недели	Спустя 8 недель
1.Кол-во пересеч. квадратов	50,6±7,8	24,5±3,63	15,0±4,6
2. Верхние стойки	7,7±2,47	3,12±1,2	1,78±0,91*
3. Груминг	3,0±1,04*	1,8±0,5*	0,89±0,13
4. Столбики	3,6±1,04	1,34±0,47*	0,89±0,26*
5. 3аглядывания в отверстия	0,3±0,13*	0,2±0,11	0,3±0,12*
Примечание: * достоверные отличия (р>0,05) относительно исходных данных

Таблица №4
Сон под действием наркоза
Группа животных	латентное время засыпания, мин	время сна, мин
Контрольная группа	4,9±0,39	112,3±9,4*
Опытная группа	4,7±0,52*	60,3±5,9
Интактная группа	4,5±0,52	48,25±4,42*
Примечание: * достоверные отличия (р>0,05) относительно исходных данных

Таблица №5
Полифенольные соединения экстракта травы кориандра
Идентифицированные соединения	Время удерживания, мин	Количественное соотношение, %
Феруловая кислота	5,87	7,24
Галловая кислота	6,2	13,51
Хризоэриол	17,05	5,55
Эскулин	7,3	2,7
Диосмин	8,6	6,27
Дикумарин	7,8	6,84
Эскулетин	9,9	1,94
Витексин	12,9	4,76
Ориентин	15,4	10,71
Скополетин	22,03	2,03
Гиперозид	25,7	0,33
Рутин	28,9	1,06
Гесперидин	33,23	5,29
4-оксикумарин	34,89	2,11
Умбеллиферон	36,95	1,4
Виценин	40,36	0,83
Катехин	72,0	0,13
Лютеолин	85,07	0,14
Апигенин	99,55	0,22
Кверцетин	68,05	0,13