средство, обладающее ингибирующей способностью по отношению к обратной транскриптазе вируса иммунодефицита человека

Формула изобретения

Средство, обладающее ингибирующей способностью по отношению к обратной транскриптазе ВИЧ (IC₅₀ 5·10 ^-7 М), характеризующееся тем, что оно представляет собой пентапептид строения Tyr-Pro-Ile-Glu-MeHis, имеющий молекулярную массу 672 Da и полученный из экстракта гомогената внутренностей морского червя Polychaeta, Eunicidae путем последовательной очистки гидрофобной хроматографией и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области вирусологии и медицины, а именно к созданию средств для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

К настоящему времени известен целый ряд соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), в том числе используемых в медицинской практике. К ним относятся производные нуклеозидов и так называемые ненуклеозидные ингибиторы. Среди производных нуклеозидов чаще всего используется 3'-азидо-3'-дезокси тимидин (AZT), 2',3'-дидезоксицитидин, 2',3'-дидезоксиинозин, 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин и 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин [Е.De Clercq. New development in anti-HIV chemotherapy. Biochim. Biophys. Acta, 2002. 1587, 258-275]. Механизм действия нуклеозидных ингибиторов состоит в том, что после проникновения в инфицированные клетки они подвергаются трифосфорилированию клеточными киназами и специфично блокируют синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой (ОТ) ВИЧ. Однако из-за низкой эффективности внутриклеточных превращений используемые препараты требуют высоких доз применения, что вызывает появление выраженных токсических эффектов (анемия, подавление деятельности клеток спинного мозга, выражающееся в миопатии, а также нарушение функции печени).

Ряд синтетических пептидных препаратов был предложен в качестве ингибиторов ОТ ВИЧ. Новый подход к созданию препаратов, ингибирующих ОТ ВИЧ-1, предложили французские исследователи [M.Morris, V.Robert-Hebmann, L.Chaloin, J.Mery, F.Heitz, C.Devaux, R.Goody, G.Divita. A new potent HIV reverse transcryptase inhibitor. J. Biol. Chem. 1999. 274(35), 24941-24946]. Известно, что ОТ ВИЧ-1 и ВИЧ-2 являются гетеродимерами, формирующимися в два этапа. Вначале происходит быстрая ассоциация двух субъединиц, затем - медленное конформационное изменение полученного комплекса с образованием активной формы фермента. Авторы изучили синтетические 10-20-членные пептиды, имитирующие фрагменты аминокислотной последовательности ОТ в районе остатков 395-404. Предполагаемый механизм ингибирования в данном случае заключался в затруднении образования активного гетеродимера фермента. Ингибирование ОТ этими соединениями in vitro в работе не исследовалось; подавление продукции вируса отмечалось при концентрации одного из пептидов (самого активного) - 10-100 нМ. Авторы полагают, что низкая токсичность и отсутствие побочных эффектов делают полученные препараты весьма перспективными.

Ю.Энгель, Б.Кутчер, М.Бернд, У.Нимайер от имени заявителя Акта Медика Акциенгезельшафт (DE) запатентовали изобретение "Лекарственное средство для лечения вирусных инфекций, СПИДа и/или СПИД-ассоциированного комплекса..." [RU 2154492 С2, 2000.08.20], где описали синтез восьми нона- и декапептидов, аналогичных кластеру триптофана с поверхности субъединиц вирусных частиц, общей формулы LHRH (p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ₂). Каждый из вариантов формул I-VIII содержал замены 5-6 аминокислот. Эти аналоги в опытах по скринингу ВИЧ на клетках CEM-IW демонстрировали антивирусное действие, а также стимулировали рост клеточных культур; соединения имели незначительную токсичность даже при максимальных дозах применения. Для исследуемых пептидов значения ЕС₅₀ составляли (в опытах NCI) от 5,9×10^-7 до 2,0×10 ^-5 моль/литр (Ср. с контрольным азидотимидином, EC ₅₀ 3,1×10^-9 моль/литр). Обработанная инфицированная культура показала величину ЕС₅₀ 4,5 моль/литр. Синтезированные пептиды по скринингу на анти-ВИЧ активность были активными или умеренно активными - значения ЕС ₅₀ находились в интервале 4-15 мкМ. Терапевтический индекс соединений (IC₅₀/EC₅₀ ) превышал 7,3.

Кроме того, из различных природных источников (растений и микроорганизмов) выделены ингибиторы ОТ различной химической природы - кумарины, флавоноиды, таннины, алкалоиды, лигнаны, терпены, нафто- и антрахиноны, полисахариды и др. [G.Matthee, A.Wright, G.Konig. HIV reverse transcryptase inhibitors of natural origin. Planta Medica, 1999. 65, 493-506]. Эффективность ингибировання ОТ этими соединениями варьировала от IC₅₀ >50 мкМ до IC₅₀ 2-3 мкМ, хотя для некоторых производных галловой и дигалловой кислот, выделенных из Mallotus repandus (Euphorbioceae) и из P.niruri, значения IC ₅₀ достигали 0,05 мкМ.

Механизм действия большинства ненуклеозидных ингибиторов окончательно не установлен. Показано, что некоторые из них (применяемые в клинике невирапин и делавердин) непосредственно связываются с ОТ, нарушая ее полимеразную активность. Резистентность к этим препаратам развивается даже быстрее, чем к нуклеазидным аналогам.

В вышеупомянутой работе имеется также обзор ингибиторов ОТ, выделенных из морских организмов. Наибольшее количество их найдено в губках (Sponge), причем строение и действие их разнообразно: аварон Е и аварол F из Dysidea avara ингибируют ОТ ВИЧ-1 с эффективностью IC₅₀ 2,8 и 21 мкМ соответственно; несколько родственных по структуре веществ из других губок ингибируют ОТ слабее (IC ₅₀ 15 мкМ).

Также из губок выделены ингибиторы ОТ иной химической природы (вещества, подобные хинонам) и серия гексапреноидов и гидрохинонов. Среди последних найден наиболее мощный ингибитор ОТ ВИЧ-1 - токсиюзол (IC₅₀ 1,5 мкМ). Многочисленные изученные вещества из губок Красного моря, о.Фиджи (алкалоиды) действуют на ОТ значительно слабее (IC₅₀˜3 мМ).

Из моллюсков Buccinilum sp. был выделен ряд гомологов келлитинина (ранее описанного соединения из моллюска Kelletia sp.). Помимо найденного антибактериального действия келлитинин проявлял также способность ингибировать ОТ ВИЧ-1 (IC₅₀=12 мкМ). Из красных и бурых водорослей разных видов выделены полисахариды, близкие по структуре к каррагинану и сравнимые по ингибирующей способности с аналогичными сульфатированными полисахаридами типа гепаринов и дерматансульфатов. Для наиболее активных из них IC₅₀ составляла 13-30 мкМ (G.Matthee, A.Wright, G.Konig, 1999. HIV reverse transcriptase inhibitors of natural origin. Planta Medica, 65, 493-506).

В целом, проведенные к настоящему времени исследования соединений из морских организмов не позволили получить обнадеживающие результаты: многие вещества действуют неспецифически, обладают слабой эффективностью ингибирования и/или слишком высокой токсичностью. Тем не менее, авторы считают морские организмы слабо изученными, но перспективными источниками, представляющими мощный ресурс для исследований, как по разнообразию структур встречающихся в них ингибиторов, так и по биологической активности.

Ингибиторов из природных источников, имеющих пептидную природу, до настоящего момента обнаружено не было.

Задача изобретения - расширение арсенала лекарственных средств ненуклеозидной природы против ВИЧ.

Неожиданно нами было обнаружено, что имеющаяся у морского червя Polychaeta вида Eunicidae способность ингибировать обратную транскриптазу вызвана наличием вещества пептидной природы.

Задача решена новым средством, названным эуницит, обладающим ингибирующей способностью по отношению к обратной транскриптазе ВИЧ, характеризующимся тем, что оно представляет собой пентапептид строения YPIEX, имеющий молекулярную массу 672 Да и полученный из экстракта гомогената внутренностей морского червя Polychaeta, Eunicidae путем последовательной очистки гидрофобной хроматографией и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в расширении спектра природных ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ - впервые веществом пептидной природы.

Технический результат заключается также в повышении эффективности ингибирования обратной транскриптазы ВИЧ. Так, заявляемый ингибитор активен в концентрации IC₅₀ 5×10 ^-7 М, тогда, как его синтетический аналог ингибирует ОТ ВИЧ в концентрации IC₅₀ 10 ^-5 M, т.е. в концентрации, в 100 раз превышающей концентрацию заявляемого средства.

Для сравнения с выделенным ингибитором авторами был синтезирован контрольный пептид строения YPIER, по первым четырем аминокислотам идентичный заявляемому. Аминокислотная последовательность YPIER распространена в природе, входит в состав актинов всех живых организмов - от микробов до человека. Однако никто не исследовал этот пептид в качестве ингибитора ОТ ВИЧ. Авторы сделали это впервые, причем обнаружили, что пептид YPIER в 100 раз менее активен, чем заявляемый эуницит. Идентификация заявляемого ингибитора как пентапептида строения YPIEX доказывает актуальность исследования морских беспозвоночных, в частности вида Polychaeta, распространенного как в тропических районах Океании, так и в Дальневосточных морях, для поиска новых пептидных ингибиторов ОТ, и перспективность использования этих пептидов для структурно-функционального анализа ОТ. Морской червь Polychaeat, Eunicidae, из которого выделено заявляемое средство, обитает в тропических водах района Сейшельских островов.

На фиг.1 представлена первая стадия очистки - хроматограмма элюции препарата с гидрофобного сорбента Полихром.

На фиг.2 представлена вторая стадия очистки - хроматограмма II фракции ОФ ВЭЖХ на колонке C18, Nova Pak. Waters, хроматограф Du Pont 8800, США, с детекторами: UV-спектрофотометр, 280 нм (Du Pont, США) и Uvicord SII, 226 нм (Farmacia LKB, Швеция); в градиенте (40 мин): буфер А - 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ), буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А.

На фиг.3 (третия стадия очистки) представлена хроматограмма фракции 7 (см. фиг.2) ОФ ВЭЖХ на колонке С18 Ultrasphere ODS, хроматограф Beckman, System Gold, США линейным градиентом концентрации ацетонитрила от 3 до 33% в 0,1%-ный растворе ТФУ, 30 мин.

На фиг.4 представлены 2-ые производные от УФ-спектров контрольных синтетических пептидов, содержащих триптофан (WVG) и тирозин (DY).

На фиг.5 представлены 2-ые производные от УФ-спектров пептидов: из фр.5, содержащего триптофан, и фр.6, содержащего тирозин (см. фиг.3).

На фиг.6 (четвертая стадия очистки) представлена хроматограмма фракции 6 с предыдущей стадии очистки ОФ ВЭЖХ на колонке CIS Ultrasphere ODS, Beckman, хроматограф Beckman, System Gold, США, линейным градиентом концентрации ацетонитрила от 3 до 33% в 0,1%-ный растворе ацетата аммония, 30 мин.

На фиг.7 дан массовый состав фр.5, четвертой стадии очистки.

На фиг.8 (окончательная очистка эуницита) представлена хроматограмма фракции 5 с предыдущей стадии ОФ ВЭЖХ на колонке С18, Милихром (Россия) линейным градиентом от 5 до 15% ацетонитрила в буфере А, 40 мин.

На фиг.9 представлены ЯМР спектры: а) эуницит; б) синтезированный аналог YPIER.

Получение эуницита

Внутренности морского червя Polychaeat, Eunicidae гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе при 4°С и экстрагировали двумя объемами холодной воды. Суспензию центрифугировали (10 мин, 6000 об/мин), супернатанты лиофилизовали.

Определение остаточной активности исходного препарата из морского червя в нескольких концентрациях по отношению к ОТ позволило вычислить IC ₅₀ 0,18 мг/мл из графика данных таблицы 1.

Таблица 1 Определение IC 50 для исходного препарата морского червя
Концентрация препарата, мкг в пробе	1	2	3	4	5	10	20
Остаточная активность ОТ, %	100	70	62	43.6	15	3.2	2.7
10 мг лиофильно-сухого порошка растворено в 1 мл воды. [с]=10 мг/мл

1-ая стадия очистки. 1 г сухого препарата, растворенного в 10 мл воды, наносили на колонку (55×125 мм) с гидрофобным сорбентом Полихром - 0.2-0.5 мм. Элюировали вещества сначала водой (200 мл), а затем ступенчатым градиентом изопропанола в воде, от 5 до 75% (по 100 мл каждого раствора). Каждую фракцию проверяли на ингибирующую способность; данные представлены в таблице 2. Хроматограмма представлена на фиг.1.

Таблица 2 Остаточная активность ОТ под действием фракций с колонки Полихром
Фракция (элюент)	I (5%-ный элюент)	II (10%-ный элюент)	III (15%-ный элюент)	IV (20%-ный элюент)	V (25-30%-ный элюент)	VI (45%-ный элюент)	VII (75-100%-ный элюент)
% активности	не опр.	10	10	20	28	36	83

Ингибирующие ОТ вещества, как видно из табл.2, вышли в основном во фракциях I-V, далее активность снижалась и исчезала совсем. Все фракции концентрировали до объема 2-5 мл и хранили в замороженном состоянии. Биологическая активность сохраняется до 3-х и более лет.

2-ая стадия очистки - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ). Активные фракции с предыдущей стадии очистки (с I по V) подвергались дальнейшему разделению обращенно-фазовой ВЭЖХ. Разделение проводилось посредством элюции линейным градиентом 40 мин буфер А - 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А. Деление материала каждой загрузки повторяли дву- или трехкратно, фракции объединяли и лиофилизовали. При этом подтвердилось хорошее разделение веществ на первой стадии очистки: если для фракции II максимум элюируемых веществ приходился на 14-22 минуты; для следующих фракций он сдвигался, от 18 до 20 минут - для фракции III, от 20 до 30 минут - для фракции IV и т.д. На фиг.2 приведена картина разделения фр.II, а также результаты определения остаточной активности ОТ, максимум которой приходился на фр.7 (17-19 мин). MALDI - определение масс веществ во фракциях дало пестрый набор величин, но позволило предположить, что активность ассоциируется с содержание вещества массы 672 Да (m672).

3-я стадия очистки. Фракция 7 была разделена на колонке ОФ ВЭЖХ С18 Ultrasphere ODS, (фиг.3). Кроме мониторинга элюции белка при 210 нм и 280 нм, в этой системе осуществляли анализ элюируемых пептидов на содержание в них ароматических соединений (в первую очередь аминокислот - триптофана, тирозина и фенилаланина), по характерным вторым производным УФ-спектров (фиг.4). Таким образом, выяснилось, что фракция 5 ( 18,1 мин) содержала триптофан, а фракция 6 ( 19 мин) - тирозин (фиг.5), причем ингибирующая ОТ активность обнаруживалась во фракции 6. Массовый состав фракции 6 - 579, 672, 808. Это подтвердило предположение об активности вещества m672.

На 4-той стадии очистки (фракции 6 из предыдущей стадии) был изменен состав элюирующей системы (вместо ТФУ использовали раствор ацетата аммония), что позволило улучшить разделение (фиг.6). В результате Tyr-содержащий пик с m672 обнаружился во фракции 5 ( 13 мин), остатки Trp-содержащего вещества вышли во фр.4 ( 10 мин). Изменение элюирующей системы позволило также отделить вещества, содержащие ароматические соединения, не принадлежащие к аминокислотам ( max 215 и 268 нм, ( 9 мин) и max 225 нм и 268 нм ( 14,8 мин) соответственно). Массовый состав фр.5 был m672, 694 (m + Na), 711 (m + К) (фиг.7), и биологическая активность была сосредоточена в этой фракции.

5-ая, окончательная процедура очистки - ОФ ВЭЖХ на колонке С18, Милихром (Россия) в градиенте от 5 до 15% ацетонитрила в буфере А (фиг.8).

Синтез близкого аналога заявляемого вещества - пептида Tyr-Pro-IIe-Glu-Arg (YPIER)

Пептид YPIER был синтезирован методом твердофазного синтеза. Чистота его подтверждена ВЭЖХ, масс-спектрометрическим анализом (масса 677 при расчетной 676,77 Да), секвенированием и спектром ¹Н-ЯМР. Пептид YPIER злюировался с колонок на 2-5-ой стадиях очистки со временем выхода ( ), отличающимся в пределах долей минуты от заявляемого природного пептидного ингибитора YPIEX m672 (эуницит). УФ-спектр YPIER совпадал с УФ-спектром YPIEX, так как оба вещества содержат тирозин.

Определение ингибирующей активности эуницита в отношении ОТ ВИЧ in vitro

Обратная транскриптаза ВИЧ была выделена из штамма продуцента (Pokholok D.K., Gudima S.O., Esipov D.S., Dobrynin V.N., Rechinsky V.O., Kochetkov S.N. Interactions of the HIV-1 reverse transcriptase 'AZT-resistant' mutants with substrates and AZT-TP FEBS Letters, 1993, 325 (3), 237-241). Активность ОТ определялась по включению -[³²P]-dATP в активированную ДНК в ферментом за 15 мин при 37°С в отсутствие и в присутствии ингибитора в нескольких разбавлениях. По окончании реакции ³²Р-меченую ДНК осаждали на бумажных фильтрах (Whatman 3MM) 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ), затем фильтры промывали дважды 5%-ным раствором ТХУ, сушили, и радиоактивность определяли на сцинтилляционном счетчике. Для эуницита получена величина IC₅₀ 5×10 ^-7 М, для контрольного синтетического пептида YPIER - 10 ^-5 М. Механизм ингибирования был неконкурентным по отношению к нуклеотидному субстрату и смешанным по отношению к матрице.

Действие эуницита на клетки

С фракциями, содержащими эуницит (1-ая стадия очистки), проводили эксперименты по действию на инфицированные ВИЧ-I и неинфицированные клетки МТ-4. Было показано, что фракции II-IV (табл.3) - высокотоксичны для ВИЧ-инфицированных клеток, но не оказывали влияния на неинфицированные клетки. При этом фракция IV ингибировала также продукцию антигена ВИЧ р24.

Таблица 3
Фракция	СД50 мкг/мл	Оптическая плотность
		Неинфицированные клетки			Инфицированные клетки			Без препарата
		500 мкг/мл	100 мкг/мл	10 мкг/мл	500 мкг/мл	100 мкг/мл	10 мкг/мл
II	840	0,711	1,013	>1	0,158	0,475	0,778	Контроль клеток 1,273-1,211 / Контроль вируса 0,868-0,814
III	>500	0,773	1,15	>1	0,319	0,341	0,605	Контроль клеток 1,189 / Контроль вируса 0,528
IV	>500	0,703	0,94	0,987	0,28	0,362	0,528
Работа выполнена в лаборатории д.х.н. Покровского А.Г., г. Новосибирск, п. Кольцово, ГНЦВБ "Вектор".

Исследование структуры эуницита (m672)

I. Аминокислотный состав фр.5, после 5-ой стадии очистки, определенный на аминокислотном анализаторе Hitachi L-8800 ААА, показал наличие Glu, Pro, Ile, Tyr, а также His ( 25 мин), пик которого частично перекрывался огромным пиком аммиака ( 24-25,5 мин). Из литературных данных известно, что пик метилгистидина в аминокислотном анализе полностью попадает под пик аммиака и поэтому не виден.

II. Секвенирование дало последовательность Tyr-Pro-Ile-Glu-X (последняя аминокислота не определена).

III. Сравнительное изучение эуницита (YPIEX, m672) из морского червя и синтетического пептида YPIER (m677).

1. Данные по масс-фрагментации

Масс-спектры синтетического пептида YPIER подтверждают его строение: [М+Н] ⁺ m/z 677, [М+2Н]²⁺ m/z 339, [M+Na] ⁺ m/z 699, пики в CID MS/MS a₄ m/z 475, b₂ m/z 261, b₃ 374, b₄ 503, b₅ 659; y₁ 175, y₂ 304, y₃ 417, y₄ 514. Большой пик m/z 521 может быть интерпретирован как [b ₄+Н₂О]⁺. Воспроизводимость спектров MS и MS/MS по указанным пикам на масс-спектрометрах, LCQ Thermo Finnigan и LC-MSD-Trap SL, Agilent Tech. - хорошая.

В спектрах природного пептида YPIEX псевдомолекулярный ион [М+Н]⁺ (m/z 672) смещен на 5 Да в меньшие массы. Пептид с m/z 336.8 может соответствовать двухзарядному иону [М+2Н]²⁺ с массой 673,6 Да. В спектре CID MS/MS m/z 672 m/z имеется заметный пик m/z 503, совпадающий с b4 синтетического пептида (при этом соответствующие пики b ₁-b₃ в этом спектре отсутствуют). В этом же спектре присутствуют пики с m/z 170, 299, 412 и 509, отличающиеся от соответствующих y₁, у ₂, у₃, У₄ синтетического пептида на 5 Да. Совокупность этих данных позволяет предположить, что в природном полипептиде цепь YPIE сохранена, но на С-конце присутствует некая аминокислота, отличающаяся от Arg на 5 Да. Ни одна из кодируемых аминокислот не соответствует этому условию. Из достаточно распространенных модифицированных аминокислот подходит цистеиновая кислота (боковая цепь - CH₂ SO₃Н, масса остатка 151 Да), а из редких и необычных аминокислот - N-метилгистидин (137+14=m151).

Версия с С-концевой цистеиновой кислотой в ходе изучения YPIEX не подтвердилась. Так, многократно повторяемая нами двумерная ТСХ дансилированных аминокислот кислотного гидролизата m672 ни разу ни показала присутствия цистеиновой кислоты. Напротив, наличие С-концевого остатка His в эуниците подтверждает сравнение ЯМР спектров его и синтетического пептида YPIER (см. ниже).

2. Данные ЯМР спектроскопии (см. фиг.9а и б)

Эуницит, масса 672. ¹Н-спектр (90% H₂ O/10% D₂O, 600 МГц) в частях на миллион; 8,5-6,9, несколько мультиплетов, амидные и ароматические сигналы; 8,48, 8,18, 8,02 HN основной цепи остатков Glu, Ile и His* соответственно; 8,42, 7,16, ароматические 1, 2 Н His; 7,18, 6,86 и 7,13, 6,88, ароматические , Н Tyr в основной trans и минорной cis конфомациях пептидной связи Tyr-Pro, соответственно; 4,51-4,14, несколько мультиплетов; 4,51, 4,42, 4,21, 4,20 и 4,14, С Н остатков Pro, His*, Glu, Tyr и Ile, соответственно; 3,75-0,8, много мультиплетов, сигналы от боковых цепей остатков Tyr, Pro, Ile, Glu, и His*.

Синтетический пентапептид YPIER, масса 677. ¹Н-спектр (90% H₂ O/10% D₂O, 600 МГц) в частях на миллион; 8,5-6,9, несколько мультиплетов, амидные и ароматические сигналы; 8,54/8,46, 8,34/8,19, 8,00/8,02 HN основной цепи остатков Glu, Ile и Arg в cis/trans конформациях пептидной Tyr-Pro связи, соответственно; 7,25, 6,91 и 7,18, 6,94, ароматические , Н Tyr в основной trans и минорной cis конфомациях пептидной связи Tyr-Pro, соответственно; 4,54-4,18, несколько мультиплетов; 4,54, 4,52, 4,36, 4,19 и 4,18, С Н остатков Pro, Tyr, Glu, Arg и Ile, соответственно; 3,75-0,8, много мультиплетов, сигналы от боковых цепей остатков Tyr, Pro, Ile, Glu, и Arg.

3. Анализ банков данных

Поскольку ни цистеиновая кислота, ни N-метилгистидин не имеют сокращенной абревиатуры, прямой поиск по банку данных содержащих их белковых структур невозможен. В связи с этим были проведены поиски структур, содержащих последовательность с преполагаемыми аминокислотами в немодифицированном варианте - YPIEC и YPIEH. Поиск проводили по базе данных Gene Bank версия III (1999). В черве Caenorhabditis elegans, геном которого полностью установлен, нет ни одного фрагмента YPIEC. Из всех других организмов программа показала наличие YPIEC у 25 объектов. Наиболее часто этот фрагмент встречается у ряда ферментов из самых разных источников (от вирусов и микроорганизмов до человека): аминопептидазы N, глутаминами нотранс-феразы, металлзависимой гидролазы, пропионатлигазы, топоизомеразы и т.п. Напротив, последовательность YPIEH в С.elegans встречалась довольно часто - 13 раз: в актинах и их изоформах, в изоформе С актина (56 YPIEH 60 и 26 YPIEH 30), а также в карбоксипептидазе Т27АВ (101 YPIEH 105), гипотетической лизосомальной тиолредуктазе (201 YPIEH 205) и пр. Из всех других организмов программа показала наличие YPIEH у 38 объектов. Почти все они относятся к семейству актинов: подобные актину, изоформа актина, -актин, -актин, -актин из самых разных объектов, например скелетной мышцы человека (71 YPIEH 75), морского организма Ascidia sydneiensic, кукурузы, Arabidopsis thaliana, дрозофилы и т.д.

Интересен тот факт (L.R.Solomon and P.A.Rubinstein (1987) Studies of the role of actin s Nt-methylhistidine using oligodeoxynuleotide-directed site-specific mutagenesis J.Biol.Chem. 262(23), 11382-11388), что во всех известных молекулах актина пост-трансляционная модификация гистидина в метилгистидин (MeHis) найдена в высококонсервативном остатке гистидина в положении 73 в составе пептида YPIEMeHis. Вероятно, заявляемый нами пептид, YPIEMeHis, содержащий редкую необычную аминокислоту MeHis, и является частью белковой последовательности актина из Polychaeta, Eunicidae.