способ повышения всхожести семян пшеницы, пораженных клопом вредной черепашки

Формула изобретения

Способ повышения всхожести семян пшеницы, пораженных клопом вредной черепашки, характеризующийся тем, что проводят обработку семян выдерживанием их в растворе лектина штамма Azospirillum brasilense Sp 7 с концентрацией 20-40 мкг/мл в течение 30-60 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а точнее к растениеводству, и касается технологий, направленных на борьбу с насекомыми, являющимися вредителями зерновых культур. Основой заявляемой технологии является вещество, оказывающее регулирующее воздействие на биохимические процессы в клетках пораженных растений, ведущее к повышению качества конечной продукции процесса выращивания растений, определяемого биологической ценностью накопленных в нем соединений, необходимых для питания человека.

В южных районах страны, в Поволжье, а в последние годы и в лесостепной зоне России все большее распространение получило повреждение зерен клопом - вредной черепашкой. Заражению вредной черепашкой подвержены все зерновые культуры, особенно пшеница. Известно, что пораженные семена дают меньшее количество растений, более низкую продуктивность стеблей, меньшую среднюю длину колоса, большее количество мелких зерен, меньшую энергию прорастания и всхожесть. При повреждении зерна всхожесть семян снижается на 38% (Казаков Е.Д., Кретович В.Л. Биохимия зерна и продуктов его переработки. М.: Колос, 1980. 319 с.). При прорастании семян существенную роль играют собственные гидролизы растений. Под их влиянием происходит гидролиз важнейших составных веществ зерна - белков, углеводов и жиров (Кретович В.Л. Биохимия зерна. М.: Наука. 1981, 150 с.).

Известны способы борьбы с поражениями зерновых культур клопом вредной черепашки, основанные на обработке вегетирующих растений смесями различных составов, включающих природные, химические, биологические и другие компоненты.

В частности, известен способ, заключающийся в обработке семенного материала раствором природного минерала бишофита. Раствор бишофита активируют магнитным полем мощностью 200-450 Э. Концентрация бишофита 15-100 мас.% от исходного рассола, расход 10-15 л/т семян. Использование активированного раствора минерала бишофита обеспечит повышение урожайности сельскохозяйственных растений и устойчивость растений к неблагоприятным условиям (жаростойкость, морозоустойчивость), к некоторым, в первую очередь, сосущим (тля, трипсы, клопы) вредителям и к развитию и распространению фитопатогенов (ржавчина, пыльная головня, септориоз, мучнистая роса и др.). (Патент на изобретение РФ №2224399, МПК: А01N 63/00).

Недостатком данного способа является его сложность и высокая себестоимость.

Известен способ обработки зерна пшеницы, поврежденной клопом-черепашкой, основанный на термической обработке зерна, рекомендуемой производить после уборки урожая пшеницы, поврежденного клопом-черепашкой. Способ предусматривает увлажнение зерна до влажности 15-19,4%. После увлажнения формируют партию поврежденного зерна массой не менее 50 т, проводят обработку тепловоздушной смесью в течение 1,5-5 секунд, обеспечивая нагрев зерна до температуры 55-75°С, и охлаждают зерно до температуры, равной температуре окружающей среды. (Патент на изобретение РФ №2247603, МПК: В02В 1/00).

Недостатком данного способа является его повышенная энергоемкость и возможная инактивация гидролитических ферментных систем при влажном разогреве зерна, принимающих активное участие при прорастании зерновок.

Известен способ защиты сельскохозяйственных культур от вредных насекомых, в котором вегетирующие растения обрабатывают смесью суспензии нематод Steinernema caprocapsae и инсектицида Циткор, концентрация которого десятикратно ниже рекомендуемой рабочей. Способ повышает надежность защиты сельскохозяйственных культур от имаго вредных насекомых при одновременном снижении токсической пестицидной нагрузки (Патент на изобретение №2255480, МПК: A01N 63/00, A01N 25/00).

Данный способ характеризуется использованием смеси, в состав которой входят биологический и химический компоненты. Наличие биологической компоненты снижает токсическую пестицидную нагрузку на растение, создаваемую вредной химической компонентой, однако не исключает ее полностью. Кроме того, способ предусматривает обработку уже вегетирующих растений, которые являются ослабленными из-за воздействия вредных насекомых, в частности клопа вредной черепашки, что снижает последующую урожайность культур.

Известен способ защиты сельскохозяйственных культур от вредных насекомых, предусматривающий обработку вегетирующих растений смесью суспензии нематод Steinernema caprocapsae и биогенного инсектицида Биостат (Ивахненко О.А. Видовой состав, распространение энтомопатогенных нематод и их эффективность против основных вредителей картофеля в Краснодарском крае. Автореферат дис.к.б.н. - Краснодар: ВНИИБЗР, 2001, с.16-20).

Недостатки вышеуказанного способа характерны и для данной технологии.

Наиболее близким к заявляемому является способ защиты сельскохозяйственных культур от вредных насекомых, предусматривающий обработку вегетирующих растений смесью суспензии нематод Steinernema caprocapsae и инсектицида, в качестве которого используют Суми-альфа в концентрации 0,01 л/га. Способ позволяет повысить надежность защиты растений при снижении токсической пестицидной нагрузки (Патент на изобретение №2259718, МПК: A01N 63/00).

Однако в данном способе также присутствует вредное химическое вещество, оказывающее токсичную пестицидную нагрузку на растение. Кроме того, данный способ характеризуется также недостаточной эффективностью защиты от вредных насекомых семенного материала, отрицательно сказывающейся на урожайности.

Задачей изобретения является повышение урожайности зерновых культур, пораженных клопом вредной черепашки, при полном исключении токсического воздействия.

Технический результат заключается в повышении всхожести зерна на 40%.

Поставленная задача решается тем, что в способе, включающем обработку зерновых культур раствором, согласно изобретению в качестве раствора выбирают раствор лектина штамма Azospirillum brasilense Sp 7 с концентрацией 20-40 мкг/мл, а обработку проводят выдерживанием семенного материала зерновых культур в растворе в течение 30-60 мин.

В известных источниках информации отсутствуют сведения о влиянии лектина штамма Azospirillum brasilense Sp 7 на активность гидролитических ферментов зерновок пшеницы, пораженных клопом вредной черепашки. Авторами были проведены исследования, в результате которых была доказана связь активности гидролитических ферментов пораженных зерновок с параметрами их всхожести. В результате проведенных исследований было обнаружено влияние данного лектина, выделенного с поверхности штамма почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense Sp 7 и взятого в определенной концентрации, на активность , -глюкозидаз и -галактозидазы, протеолитических ферментов корней проростков пораженных зерновок, обработанных раствором данного лектина.

Способ осуществляется следующем образом.

Проводят обработку зерновых культур раствором лектина штамма Azospirillum brasilense Sp 7, который может быть получен, например, по технологии, описанной в Авторском Свидетельстве №1312773. Для обработки используют раствор с концентрацией 20-40 мкг/мл. При этом обрабатывают непосредственно семенной материал зерновых культур, например, погружением их в раствор на 30-60 мин или распылением для обеспечения воздействия лектина в течение указанного времени.

Пример конкретного выполнения.

Для получения препарата лектина штамма Azospirillum brasilense Sp 7 культуры бактерий выращивали на жидкой синтетической среде для флоккуляции при 37°С в течение 18 ч (Echdat Y., Ofek I., Yachow-Yan Y., Sharon N., Mirelman D.Isolation of mannose-specific lectin from E.coli and its role in the adherence of the bacterial to epithelial cells // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1978. V.85. P.1551-1559). Бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. После осаждения клетки отмывали 0,9%-ным раствором NaCl. Затем клетки суспендировали в буферно-солевом растворе следующего состава (г/л): NaCl - 49,3; Na₂HPO ₄·2H₂О - 1,34; NaH ₂PO₄·2H₂ О - 0,39; pH 7,4; из расчета 100 мл на 10 г биомассы. Суспензию перемешивали на магнитной мешалке 3 мин. Биомассу отделяли центрифугированием (10000 g, 20 мин) и отбрасывали. К 100 мл полученного супернатанта добавляли 82 мл насыщенного раствора (NH₄ )₂SO₄. Выпавший хлопьевидный осадок лектина отделяли центрифугированием и растворяли в 20 мл 0,95-ного раствора NaCl. К раствору добавляли 40 мл 96%-ного этилового спирта или ацетона и оставляли на два часа при 4°С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, растворяли в 15 мл дистиллированной воды, диализовали в течение 18 часов при 4°С. Концентрацию лектина определяли по методу Бредфорд (Bradford M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal Biochem. 1976. V.72. №1. P.248-254.), затем доводили концентрацию до 30 мкг/мл. Эксперимент был проведен на семенах мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29, которые были получены из НИИ сельского хозяйства Юго-Востока (Саратов). Из корней 4-суточных проростков пшеницы сорта Саратовская 29, выращенных в асептических условиях из поверхностно-стерилизованных зерновок, была получена фракция экзокомпонентов, мембранная фракция (Полевой В.В., Максимова Г.М. Методы биохимического анализа растений. Ленинград: Изд-во Ленингр. ун-та, 1978. 192 с.10), фракция апопластов (Rohringer R., Ebrahim-Nesbat F., WolfG. Protein in intercellul ar washing fluid from leaves of Barley (Hordeum vulgare) // J.Exp.Bot. 1983. V.34. P.1589-1605.11). Рабочие растворы фракций содержали 30 мкг/мл, 3 мг/мл и 10 мкг/мл белка соответственно. Фракции инкубировали с раствором лектина вышеуказанной концентрации в течение 40мин.

Активность , -глюкозидаз и -галактозидазы, протеолитических ферментов корней проростков пораженных зерновок была определена до и после их обработки раствором данного лектина.

Активности -, -глюкозидаз и -галактозидазы определяли по количеству нитрофенола, образовавшегося из субстрата 4-нитрофенил- -D-глюкопиранозида, 4-нитрофенил- -D-глюкопиранозида и 4-нитрофенил- -D-галактопиранозида соответственно (Carbohydrate analysis / Ed.Chaplin M.E., Kennedy J.E. Oxford: IRL Press. 1986. 228 p.12). Количество образовавшегося нитрофенола определяли спектрофотометрически при =425 нм. За единицу активности фермента принимали то его количество, которое превращало 1 нМ субстрата за 1 мин. Удельную активность ферментов выражали, относя количество единиц активности ферментов к количеству мг белка. Оценку протеолитической активности проводили с использованием методики с азожелатином (Jones B.L., Fontanini D., Jarvinen M., Pekkarinen A. Simplified endoproteinase assays using gelatin and azogelatin // Anal. Chem. 1988. Vol.263. P.214-220.13). За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, вызывающее повышение оптической плотности раствора на 0.1 при 440 нм за 120 мин. Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента (Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск, 1973. 319 с.14). В результате было показано, что инкубация лектина A. brasilense Sp 7 в концентрации 30 мкг/мл с фракциями в течение 40 мин приводила к возрастанию активности растительных ферментов по сравнению с контролем, в качестве которого были взяты фракции корней проростков пшеницы, не инкубированные с пектином.

В таблице представлены результаты эксперимента, показывающие влияние лектина A. brasilense Sp 7 на активность гидролитических ферментов корней проростков пшеницы.

Таблица
Фракции	-глюкозидаза	-глюкозидаза	-галактозидаза	протеолитическая активность
Фэ	4±0.2	2±0.2	2±0.5	6±1.0
Фэ+Л	11±0.2	12±0.4	9±0.5	42±0.4
Фм	8±1.0	4±0.6	4±0.2	10±0.4
Фм+Л	12±0.5	14±1.0	11±1.0	45±0.9
Фа	12±0.9	4±0.2	7±1.0	2±0.4
Фа+Л	16±1.4	16±1.4	18±0.2	10±0.1

В таблице в столбце "фракции" приняты следующие обозначения: Фэ - фракция экзокомпонентов; Фм - мембранная фракция; Фа - фракция апопластов; Ф + Л - фракции, инкубированные с лектином.

Результаты в таблице представлены как средняя арифметическая из 5 опытов ± стандартное отклонение. Различия были статистически достоверными при Р<0.05. За единицу активности ферментов принимали те их количества, которые катализировали расщепление 1нМ субстратов за 1 мин в заданных условиях. Удельную активность рассчитывали на 1 мг белка.

Наибольшее увеличение активности всех изучаемых ферментов происходило во фракции экзокомпонентов. Значительное увеличение активности -глюкозидазы и активности протеолитических ферментов во всех фракциях для данного штамма свидетельствует о том, что лектин азоспирилл способен активизировать процесс расщепления целлюлозы и белков корней проростков и тем самым изменять концентрацию метаболитов в среде и соответственно влиять на метаболический обмен, связанный с прорастанием семян.

Полученные результаты представляют значительный интерес как для понимания биологической роли пектинов во взаимоотношениях с растениями при создании ассоциации, так и для разработки способа преодоления негативного воздействия клопа-черепашки на этапе всхожести семян. Заявленный способ борьбы с поражениями зерновых культур клопом вредной черепашки является экологичным и нетрудоемким.

Для доказательства достижения заявленного результата на различных сортах пшеницы приводим дополнительные материалы.

Влияние лектина Azospirillum brasilense Sp7 на всхожесть семян пшеницы Саратовская 29 (мягкая)
Время выдерживания в растворе лектина, мин	Всхожесть семян, %
	Контроль (без лектина)	Концентрация лектина, мкг/мл
		20	30	40	50
30	14±0.8	45±1.1	49±1.2	42±0.8	35±1.0
40	16±1.0	50±0.8	56±1.4	50±1.0	42±0.6
50	15±0.6	45±0.9	53±1.0	44±0.6	40±0.6
60	14±0.9	42±0.6	50±0.8	46±1.1	35±0.9

Влияние лектина Azospirillum brasilense Sp7 на всхожесть семян пшеницы Саратовская 57 (твердая)
Время выдерживания в растворе лектина, мин	Всхожесть семян, %
	Контроль (без лектина)	Концентрация лектина, мкг/мл;
		20	30	40	50
30	15±0.8	46±0.6	50±1.0	43±0.8	37±0.6
40	21±0.6	53±0.8	60±1.2	52±1.0	43±1.0
50	17±1.0	47±0.4	55±1.0	43±0.9	41±0.9
60	13±0.9	40±1.1	50±0.6	41±1.0	35±0.6

Влияние лектина Azospirillum brasilense Sp7 на всхожесть семян пшеницы Харьковская 46 (твердая)
Время выдерживания в растворе лектина, мин	Всхожесть семян, %
	Контроль (без лектина)	Концентрация лектина, мкг/мл
		20	30	40	50
30	10±0.6	42±1.0	45±1.0	38±0.6	33±0.8
40	14±1.2	48±0.6	52±0.6	46±1.0	43±0.4
50	12±0.6	43±0.9	50±0.8	42±0.8	40±0.6
60	9±1.0	38±0.8	45±0.6	42±1.0	33±0.9

При этом следует отметить, что предлагаемый способ позволяет повысить всхожесть, применяя экологически чистое нетоксичное вещество.