сухой диагностический сибиреязвенный аллерген
Классы МПК: | C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона A61K38/00 Лекарственные препараты, содержащие пептиды |
Автор(ы): | Васильев Никифор Трофимович (RU), Логинов Михаил Сергеевич (RU), Васильев Петр Геннадьевич (RU), Фролов Владимир Иванович (RU), Саяпина Лидия Васильевна (RU), Забокрицкий Александр Николаевич (RU), Садовой Николай Васильевич (RU), Садовая Елена Александровна (RU), Столяров Виталий Михайлович (RU), Ильиных Алексей Васильевич (RU), Фофанов Павел Ефимович (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-10-11 публикация патента:
10.01.2008 |
Изобретение относится к диагностическим иммунобиологическим препаратам, содержащим биологически активные компоненты клеток Bacillus anthracis. Способ предусматривает осуществление глубинного культивирования штамма В.anthracis штамма СТИ-1 в аппарате БИОР-1,0 в жидкой питательной средой на основе солянокислотного гидролизата рыбной муки в течение от 8 до 12 ч с последующей отмывкой, центрифугированием и девитализацией клеток. Далее из полученной бактериальной массы извлекают щелочно-растворимые компоненты. Сухой аллерген после добавления в субстанцию боратного буфера готовят в сублимационной установке LZ-45. Температурный режим высушивания регулируют подводом тепла к материалу от минус 32°С до плюс 28°С. Общая продолжительность процесса лиофилизации составляет от 20 до 24 ч. Полученный сухой аллерген содержит в дозе 20 мкг белка. Сухой сибиреязвенный аллерген в два раза превосходит по биологической активности коммерческий аналог, не изменяет свою активность при длительном хранении и эффективен при оценке напряженности противосибиреязвенного иммунитета и диагностике сибиреязвенной инфекции. 4 табл.
Формула изобретения
Сухой диагностический сибиреязвенный аллерген, характеризующийся тем, что он представляет собой термостабильную белковую фракцию вегетативных клеток вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1 с содержанием белка от 58 до 74%, содержит в диагностической дозе 20 мкг белка, получен методом щелочного гидролиза высушенной ацетоном биомассы вегетативных клеток указанного штамма, выращенных глубинным способом, и высушен сублимационным методом.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к диагностическим иммунобиологическим препаратам, содержащим биологически активные компоненты клеток Bacillus anthracis, и может быть использовано в медицине и ветеринарии.
Аналогом изобретения являлся жидкий коммерческий препарат «антраксин», производителем которого был Молдавский ИЭМГ [1-3]. В Ставропольском НИИПЧИ выпускается в ограниченном количестве только жидкий аллерген. Этот препарат из-за недостаточно высокой чувствительности, низкой сохраняемости и специфичности широкого применения в настоящее время не имеет [4]. Всероссийским научно-исследовательским ветеринарным институтом г.Казань были предприняты попытки получения аллергена из капсульного штамма сибиреязвенного микроба, однако данный препарат из-за своей высокой реактогенности в медицинскую и ветеринарную практику не внедрен [5].
Цель изобретения - создание сухой формы препарата высокоэффективного аллергена для оценки напряженности противосибиреязвенного иммунитета и диагностики сибиреязвенной инфекции, сохраняющего более длительное время свои основные свойства и содержащего в диагностической дозе в два раза меньше белка по сравнению с аналогом.
Поставленная цель достигается выделением из микробных клеток вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 аллергенной фракции, приготовлением на ее основе сухого диагностического препарата сибиреязвенного аллергена, превосходящего по биологической активности аналогичный жидкий препарат Ставропольского НИИПЧИ и сохраняющего свои свойства не менее 3 лет.
Сущность изобретения состоит в получении сухого сибиреязвенного аллергена методом щелочного гидролиза микробных клеток вакцинного штамма СТИ-1 [6]. Бактериальную массу вегетативных клеток получают путем глубинного культивирования в аппарате БИОР-0,1 с жидкой питательной средой на основе солянокислотного гидролизата рыбной муки и кукурузного экстракта с добавлением глюкозы, солей кальция и марганца при температуре от 31°С до 33°С в течение от 8 до 12 ч и скорости вращения мешалки 500 оборотов в минуту. Клеточную массу отмывают физиологическим раствором хлорида натрия и высушивают ацетоном. Выделение аллергенной фракции осуществляют методом щелочного гидролиза, который включает в себе следующие основные стадии: извлечение из ацетонвысушенных клеток щелочерастворимых компонентов, последующее осаждение их уксусной кислотой, растворение полученного осадка в физиологическом растворе хлорида натрия, диализ (жидкая субстанция аллергена), получение сухой субстанции аллергена, приготовление сухой диагностической формы аллергена. Препарат аллергена готовят из сухой субстанции путем растворения необходимой навески в боратном буфере с рН 7,2 с последующим автоклавированием и фильтрацией раствора аллергена через мембранные фильтры для удаления балластных термолабильных белков. Сублимацию препарата осуществляют в установках LZ-45.27 или АКСС. Температурный режим высушивания регулируют подводом тепла к материалу от минус 32°С до плюс 28°С. Общая продолжительность процесса сублимационного высушивания составляет от 20 до 24 ч.
Пример 1. Полученный методом щелочного гидролиза сибиреязвенный аллерген представляет собой термостабильную белковую фракцию микробных клеток вакцинного штамма СТИ-1 (содержание белка от 58% до 74%).
Характеристики препаратов аллергена приведены в таблице 1. Приготовленные серии сибиреязвенного аллергена были безвредны для белых мышей, не содержали посторонней микрофлоры, имели рН 7,2, остаточную влажность не более 5% и содержали в одной диагностической дозе (0,1 мл) 20 мкг белка.
Пример 2. Биологическую активность сухого аллергена оценивали в сравнении с коммерческим антраксином. Для этого использовали четырехкрестовую шкалу и рассчитывали индекс интенсивности реакции, как наиболее информативный показатель кожно-аллергической пробы.
Оценку препаратов проводили на однократно вакцинированных сибиреязвенной вакциной СТИ-1 морских свинках. Для постановки аллергической пробы использовали дозы 20 и 40 мкг белка в объеме 0,1 мл, для антраксина производства Ставропольского НИИПЧИ согласно инструкции по применению - 40 мкг (таблица 2). Интенсивность реакции учитывали через 24 часа после постановки внутрикожной пробы по среднему диаметру гиперимии с инфильтратом.
Как видно из представленных в таблице 2 данных, индекс интенсивности сухого аллергена для дозы 20 мкг почти в два раза больше, чем для коммерческого препарата (40 мкг).
Результаты сравнительных экспериментальных испытаний препаратов приведены в таблице 3. В опытах использовались морские свинки, зараженные культурой штамма 71/12 второй вакцины Ценковского. Отмечено, что предлагаемый аллерген производства ЦВТП БЗ более эффективен, чем коммерческий: так, при постановке кожно-аллергической пробы в дозе 20 мкг индекс интенсивности выше, чем у Ставропольского антраксина при дозе 40 мкг.
Испытания хранившегося аллергена проводили по методике, описанной выше. Условия хранения аллергена были следующими: 1, 2 и 3 года при температуре от 2°С до 10°С и один месяц перед испытаниями при температуре от 25°С до 30°С. Из представленных в таблице 4 данных следует, что активность сухого аллергена после 3 лет хранения (срок наблюдения) находится на уровне свежеприготовленного, что создает удобства для его хранения, транспортировки вне зависимости от времени года.
МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таблица 1 - Характеристика препаратов аллергена, полученных на основе | ||||||||
глубинных культур СТИ-1 | ||||||||
Серии препарата | Жидкая субстанция аллергена | Сухая субстанция аллергена | Сухая диагностическая форма аллергена | |||||
рН | Белок, мг/мл | Нуклеиновые кислоты, мг/мл | Выход с 1 л культуральной жидкости, % | Выход по белку, % | Белок в дозе, мкг | рН | Остаточная влажность, % | |
1 | 7,2 | 2,74 | 0,008 | 11,2 | 8,5 | 20 | 7,2 | 4,9 |
2 | 7,2 | 2,46 | 0,006 | 16,4 | 11,0 | 20 | 7,2 | 4,3 |
3 | 7,3 | 2,60 | 0,009 | 13,7 | 12,0 | 20 | 7,2 | 4,3 |
Таблица 2 - Аллергическая проба на морских свинках, вакцинированных живой вакциной СТИ-1 | ||||
Аллерген | Доза, мкг белка | Средний диаметр гиперемии, мм | Положительных реакций, % | Индекс интенсивности, % |
Сибиреязвенный аллерген производства ЦВТП БЗ | 20 | 17,0 | 100 | 43,8 |
40 | 16,8 | 100 | 43,8 | |
Контроль | 40 | 0 | 0 | 0 |
Сибиреязвенный аллерген производства Ставропольского НИИПЧИ | 40 | 14,0 | 100 | 25,0 |
Контроль | 40 | 0 | 0 | 0 |
Примечание: контроль - интактные животные |
Таблица 3 - Аллергическая проба на морских свинках, инфицированных второй вакциной Ценковского | ||||
Аллерген | Доза, мкг белка | Средний диаметр гиперемии, мм | Количество положительных реакций, % | Индекс интенсивности, % |
Сибиреязвенный аллерген производства ЦВТП БЗ | 40 | 20,1 | 100 | 51,9 |
20 | 19,0 | 100 | 47,9 | |
Контроль | 40 | 0 | 0 | 0 |
Сибиреязвенный аллерген производства Ставропольского НИИПЧИ | 40 | 11,1 | 81 | 28,9 |
Контроль | 40 | 0 | 0 | 0 |
Примечание: контроль - интактные животные |
Таблица 4 - Физико-химические и биологические свойства аллергена на различные сроки хранения | ||||||
Срок хранения, мес | рН | Остаточная влажность, % | Концентрация белка в дозе, мкг | Средний диаметр гиперемии, мм | Количество положительных реакций, % | Индекс интенсивности реакции, % |
Исходный | 7,2 | 4,6 | 20,0 | 17,0 | 100 | 43,8 |
материал | ||||||
6 | 7,15 | 4,7 | 20,1 | 16,2 | 100 | 40,6 |
12 | 7,2 | 4,6 | 20,1 | 16,2 | 100 | 40,6 |
18 | 7,2 | 4,3 | 20,0 | 16,2 | 100 | 40,6 |
24 | 7,2 | 4,3 | 20,0 | 15,5 | 100 | 37,5 |
36 | 7,2 | 4,4 | 20,1 | 16,0 | 100 | 40,0 |
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Шляхов Э.Н. Сибиреязвенный аллерген антраксин (принципы конструирования, методы получения, экспериментальное изучение, применение в эпидемиологической практике). Автореферат дисс.докт. М., 1965.
2. Шляхов Э.Н., Шварц С.А. Авторское свидетельство СССР №219753, кл. А 39-35, 1968.
3. Шляхов Э.Н., Шварц С.А., Груз Е.В. Иммуноаллергическая диагностика сибирской язвы человека с помощью антраксина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1970. - №6, - с.79-83.
4. Фармакопейная статья. Аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы. ФС 42-3878-99.
5. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: Актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. - М., ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.
6. Рунова В.Ф., Гаврилова В.Ю. Получение бактериальных аллергенов методом щелочного экстрагирования и изучение их физико-химических свойств.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1970. - №10, - с.72-77.
Класс C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона
Класс A61K38/00 Лекарственные препараты, содержащие пептиды