способ получения растений-регенерантов в культуре пыльников проса (panicum miliaceum l.) с использованием теплового стресса

Формула изобретения

Способ получения растений-регенерантов в культуре пыльников проса (Panicum miliaceum L.) с использованием теплового стресса, включающий получение эмбриогенных каллусных тканей и растений-регенерантов, отличающийся тем, что для эффективного формирования эмбриогенных каллусов изолированные пыльники in vitro в условиях питательной среды MSB с 2 мг/л 2,4-Д выдерживают в термостате при температуре +32°С в течение 1 сут, а затем культивируют при +24°С и 16-часовом световом дне, для стимулирования регенерационного процесса каллусы переносят на среду MSB с 10 мг/л БАП и 0,5...1 мг/л НУК, а для получения корнесобственных растений-регенерантов регенерирующие каллусные ткани помещают на среду MSB без регуляторов роста.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности получению эмбриогенных каллусных тканей и растений-регенерантов в культуре пыльников проса, и может быть использовано в генетике, физиологии и селекции.

Впервые в культуре пыльников растения-регенеранты получены у вида Datura inoxia Mill. [1, 2]. Предобработка бутонов холодом (+4°С) обеспечила увеличение числа растения-регенерантов в культуре пыльников Nicotiana tabacum L. и Datura innoxia Mill. в несколько раз [3]. Обработка холодом является наиболее распространенным стрессовым воздействием на микроспоры таких злаковых культур, как пшеница, ячмень, рис, кукуруза.

Для формирования культуры пыльников проса использовали изолированные метелки, подвергшиеся стрессу низких положительных (+4°С) температур в течение 1...5 суток. Тепловой стресс ранее не применялся к культуре пыльников проса. Использование обработки метелок холодом с последующим культивированием изолированных пыльников в условиях улучшенных вариантов среды N₆ давало положительный эффект, однако частота формирования эмбриогенных каллусов не превышала 4% [4].

Предложенное стрессовое воздействие теплом на изолированные пыльники проса позволяет заметно повысить эффективность получения эмбриогенных каллусов и растений-регенерантов. В отдельных вариантах частота эмбриогенного каллусогенеза достигает 28,3%. В вариантах с тепловым стрессом на 30 высаженных пыльников получено 61,3 зеленых растения-регенеранта, в то время как после обработки холодом 46, а в контроле 19.

Изолированные пыльники высаживают на поверхность агаризованной среды MSB (среда MS с витаминами В5), дополненную 2 мг/л 2,4-Д. Культуру пыльников in vitro выдерживают в термостате +32°С в течение 1 суток. После теплового стресса пыльники культивируют при +24°С и 16 часовом световом дне. Сформированные эмбриогенные каллусные ткани для стимулирования регенерационного процесса помещают на среду MSB с 10 мг/л БАП и 0,5...1 мг/л НУК. Регенерирующие каллусные ткани переносят на среду MSB без регуляторов роста. Полученные в условиях этой среды корнесобственные растения-регенеранты высотой 1,5 см переводят в почву.

Пример. Использовали пыльники растущих в тепличном боксе растений сорта Благодатное и гибридов F ₂: Могарообразное 2172 × Благодатное, Могарообразные веточки 1904 × Благодатное, Могарообразные веточки 1904 × Соргообразное 2171, Соргообразное 2171 × Благодатное, Соргообразное 2171 × Могарообразное 2172, Соргообразный могарообразный димутант 2083 × Благодатное.

Использовали изолированные пыльники с пыльцой на mid-uninucleate ...early dinucleate стадиях развития. Изучали два типа стрессовых воздействия: тепло и холод. Обработке холодом (+4°С) в течение 6 суток подвергали срезанные метелки. Тепловой (+32°С) стресс различной продолжительности применяли к изолированным пыльникам in vitro, помещенным на поверхность агаризованных сред. В контрольном варианте пыльники изолировали из цветков свежесрезанных метелок и не подвергали стрессовым воздействиям. Каллусогенная среда была основана на протоколе MSB: MS [5] с витаминами В5 [6] и дополнительно содержала 2 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота). Для стимулирования регенерационного процесса эмбриогенные каллусы переносили на среду MSB с 0,5...1,0 мг/л НУК- -нафтилуксусная кислота и 10 мг/л БАП - 6-бензиламинопурин. Регенерация корнесобственных растений проса продолжалась в условиях среды MSB без регуляторов роста [7].

В 2004 г. изучали влияние теплового стресса (+32°С) различной продолжительности на эффективность эмбриогенного каллусогенеза. В варианте без стрессового воздействия (контроль) частота каллусогенеза составила 1,1% (табл.1). В варианте с обработкой пыльников теплом в течение 1 суток средняя частота формирования эмбриогенных каллусов составила 14%. При этом в варианте гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное частота равнялась 5% (3,3% в контроле). В варианте сорта Благодатное частота была равна 3,3% (0% в контроле). Наибольшее число эмбриогенных каллусов (28,3%) наблюдали в варианте гибрида Соргообразный могарообразный димутант 2083 × Благодатное. Стрессовое воздействие на культуру пыльников теплом в течение 2 суток обеспечивало среднюю частоту эмбриогенного каллусогенеза 3,3%. В варианте сорта Благодатное частота равнялась 6,7%. Однако у гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное она была равна нулю. Обработка пыльников теплом в течение 3 суток в варианте гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное определила частоту 1,7%, что соответствовало контрольному варианту.

В 2005 г. изучали влияние двух видов стрессовых воздействий: обработку пыльников теплом (+32°С) in vitro и метелок проса холодом (+4°С) на эффективность эмбриогенного каллусогенеза и регенерации. Всего в контроле было высажено 300 пыльников. В вариантах с тепловым и холодовым стрессами высажено, соответственно, 750 и 210 пыльников. С каждого гибридного растения изолировали и помещали на каллусогенную агаризованную среду 30 пыльников. Для того чтобы уменьшить влияние на результат неподходящих для эмбриогенеза стадий развития пыльцы анализировали только те посадки по 30 пыльников, в которых было не менее 1 эмбриогенного каллуса. В опыте использовали генетически близкие гибриды (табл.2).

Средняя частота формирования эмбриогенных каллусов в варианте с обработкой теплом (120 пыльников) составила 9,2%. Средняя частота эмбриогенного каллусогенеза в варианте с обработкой холодом (90 пыльников) равнялась 4,4%. В контроле (30 пыльников) частота была равна 3,3%.

Среднее число всех регенерантов, приходящееся на 30 пыльников, в варианте с тепловым стрессом равнялось 78,3. В варианте с холодом среднее число регенерантов составило 43,3. В контрольном варианте получено 38 регенерантов. После обработок теплом, холодом и в контроле получено, соответственно, 61,3; 42; 19 зеленых регенерантов на 30 пыльников. Процент зеленых регенерантов был, соответственно, равен 78,3; 96,9; 50.

По результатам опытов 2004 и 2005 гг. установили, что тепловая обработка изолированных пыльников при температуре +32°С в течение 1 суток заметно повышает эффективность эмбриогенного каллусогенеза и регенерации в культуре пыльников проса в сравнении с контролем и другими стрессовыми воздействиями. Особого внимания заслуживает факт массового (28,3%) формирования эмбриогенных каллусов в варианте с тепловым стрессом.

Источники информации

1. Guha S., Maheshwari S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura//Nature. - 1964. - V.204.

2. Guha S., Maheshwari S.C. Development of embryoids from pollen grains of Datura in vitro. Phyromorphalogy. - 1967. - V.17.

3. Nitsch С., Noreel В. Effet d'um choc thermiquesur le pouvoir embryogenedu pollende Datura innoxia cultive dansl'anthere ou isole de l'anthere. //C.R.Acad. Sci. (Paris). Ser. D. - 1973. - V.276.

4. Патент РФ на изобретение №2217907. Способ получения регенерантных растений в культуре пыльников проса (Panicum miliaceum L.) /С.В.Бобков/ Заявка №2001121609/13. Приоритет 31.07.2001. Зарегистрирован 10.12.2003. Бюл. №34.

5. Murashige Т., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioasseys with tobacco tissue cultures//Physil. Plant. - 1962. - V.15. - №13. - P.473-497.

6. Gamborg O., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of gluconases in cultures of wheat and barley//Can. J. Biochem. - 1968. - V.46. - №5. - Р.417-421.

7. Бобков С.В. Получение регенерантов проса и просовых культур. //Доклады Россельхозакадемии. - 2005. - №6. - С.5-7.

Таблица 1 Влияние теплового стресса на эффективность эмбриогенного каллусогенеза в культуре пыльников проса (2004 г.)
Тепловой стресс 32°С, сутки	Гибрид F 2, сорт	Высажено пыльников	Получено эмбриогенных каллусов	% эмбриогенного каллусогенеза
0(контроль)	Соргообразное 2171 × Благодатное	30	1	3,3
	Благодатное	60	0	0
	Итого:	90	1	1,1
1	Соргообразное 2171 × Благодатное	60	3	5
	Благодатное	30	1	3,3
	Соргообразный могарообразный димутант 2083 × Благодатное	60	17	28,3
	Итого:	150	21	14
2	Соргообразное 2171 × Благодатное	30	0	0
	Благодатное	30	2	6,7
	Итого:	60	2	3,3
3	Соргообразное 2171 × Благодатное	60	1	1,7
	Итого:	60	1	1,7
ВСЕГО:		360	25	6,9

Таблица 2 Эффективность эмбриогенного каллусогенеза и регенерации растений в культуре пыльников проса (2005 г.)
Тип стресса		Гибрид	Метелка	Число пыльников	Получено каллусов		Получено регенерантов			% зеленых регенерантов
					Всего	%	Всего	Зеленых	Альбиносов
Контроль		Соргообразное 2171 × Могарообразное 2172	12	30	1	3,3	38	19	19	50
		Итого:		30	1	3,3	38	19	19	50
На 30 пыльников:				30	1	3,3	38	19	19	50
32°С, 1 сутки		Соргообразное 2171 × Могарообразное 2172	14	30	2	6,6	90	75	15	83,3
		Могарообразные веточки 1904 × Соргообразное 2171	15	30	1	3,3	10	5	5	50
		Могарообразные веточки 1904 × Благодатное	30	30	1	3,3	99	90	9	90,9
		Могарообразные веточки 1904 × Благодатное	31	30	7	23,3	114	75	39	65,8
		Итого:		120	11	9,2	313	245	68	78,3
На 30 пыльников:				30	2,8	9,3	78,3	61,3	17	78,3
4°С, 6 суток	Могарообразные веточки 1904 × Благодатное		32	30	1	3,3	43	43	0	100
	Могарообразные веточки 1904 × Благодатное		34	30	1	3,3	62	58	4	93,5
	Могарообразные веточки 1904 × Соргообразное 2171		36	30	2	6,6	25	25	0	100
	Итого:			90	4	4,4	130	126	4	96,9
На 30 пыльников:				30	1,3	4,3	43,3	42	1,3	96,9
ВСЕГО:				240	16	6,7	481	390	91	81,1