способ определения скрытой активности туберкулезного процесса у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких
Классы МПК: | G01N33/68 с использованием протеинов, пептидов или аминокислот |
Автор(ы): | Салина Татьяна Юрьевна (RU), Владимирский Михаил Александрович (RU), Морозова Татьяна Ивановна (RU) |
Патентообладатель(и): | Салина Татьяна Юрьевна (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-03-09 публикация патента:
10.12.2007 |
Настоящее изобретение относится к диагностическим методам. Предложенный способ определения скрытой активности туберкулезного процесса заключается в том, что у больных с бессимптомно протекающим и ограниченным активным туберкулезом легких имеется более выраженная продукция ИФН- в ответ на стимуляцию специфическим антигеном H37Rv по сравнению с лицами, имеющими неактивные, зажившие изменения в легких. Так, при разности между индуцированной и спонтанной продукцией ИФН- в супернатантах 48 часовых культур разведенной в 10 раз венозной крови от 60 до 1400 пг/мл диагностируют активный туберкулез, а при величине от 0 до 50 пг/мл отсутствие активности туберкулезного процесса. Использование способа позволяет повысить специфичность и точность диагностических тестов на определение скрытой активности туберкулезного процесса. 2 табл.
(56) (продолжение):
CLASS="b560m"to culture filtrate fractions of Mycobacterium tuberculosis by microspheres, Journal of Immunological Methods Volume 235, Issues 1-2, 21 February 2000, Pages 1-9, найдено в PubMed 24.04.2007, PMID: 10675752.
Формула изобретения
Способ определения скрытой активности туберкулезного процесса у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких, основанный на индукции иммунокомпетентных клеток специфическим стимулятором, отличающийся тем, что у пациентов, имеющих остаточные изменения в легких и при отсутствии клинически значимых признаков активного туберкулеза, in vitro определяют продукцию ИФН- в супернатантах 48-часовых культур разведенной в 10 раз гепаринизированной венозной крови до и после внесения in vitro антигена H37Rv, и при значении разности индуцированной антигеном и спонтанной продукции ИФН- от 60 до 1400 пг/мл диагностируют активный туберкулез, а при значениях от 0 до 50 пг/мл отсутствие активности туберкулезного процесса.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиатрии и лабораторным методам исследования крови, и может быть использовано в противотуберкулезных учреждениях.
Известны способы определения скрытой активности туберкулеза у лиц с остаточными изменениями в легких путем постановки специфических туберкулинпровакационных иммунологических тестов: пробы Коха, реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), реакции торможения миграции (РТМ), реакции оценки пролиферативной активности лимфоцитов по включению Н3 тимидина [3; 1; 4].
Однако известные способы являются недостаточно специфичными, так как в них в качестве антигена используется туберкулин, который может дать перекрестную ответную реакцию у лиц инфицированных, но не больных активным туберкулезом, это в ряде случаев не позволяет отличить активный туберкулезный процесс от давнозаживших остаточных посттуберкулезных изменений в легких, следовательно, являются неточными.
Кроме того, для повышения информативности известные способы определения активности туберкулезного процесса требуют предварительного введения туберкулина в живой организм, что не всегда безопасно, т.к. в отдельных случаях может вызвать обострение туберкулеза.
Существующие методы достаточно трудоемки и длительны во времени, так в реакции РБТЛ требуется сложный морфологический подсчет пролиферирующих клеток, а в реакции оценки пролиферативной активности лимфоцитов по включению Н3 тимидина - условия работы с радиоактивностью.
Нами впервые предложен способ определения скрытой активности туберкулезного процесса у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких, основанный на определении индуцированной антигеном H37Rv продукции интерферона- (ИФН- ) в супернатантах 48-часовой культуры гепаринизированной венозной крови и заключающийся в том, что при разности между стимулированной и спонтанной продукцией ИФН- от 60 до 1400 пг/мл диагностируют активный туберкулез, а при значениях 0 до 50 пг/мл - отсутствие активности процесса.
Метод отличается от аналогов большей специфичностью, а следовательно, является более точным, так как в нем в качестве стимулятора используется антиген, полученный из вирулентного штамма микобактерий туберкулеза, отсутствием необходимости подкожного введения туберкулина в живой организм, исследования проводятся только in vitro, облегчением конечного этапа оценки результатов с помощью иммуноферментного анализатора.
Способ осуществляется следующим образом.
Для постановки реакции используется стерильно взятая гепаринизированная венозная кровь (1-3 мл), предварительно разведенная в 10 раз средой RPMI, содержащей 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1 мМоль L-глютамина и по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина. Исследования проводятся в 96-луночных культуральных планшетах, на каждого пациента используется 2 лунки. В первую лунку вносится разведенная гепаринизированная венозная кровь в количестве 200 мкл без стимулятора, во вторую - эта же кровь в равном объеме с добавлением 10 мкл антигена H37Rv в рабочей концентрации 10 мкг/мл. Технология получения антигена разработана в Российском НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, используется суспензия гамма-облученной (2,5 мегарад) биомассы вирулентного штамма H37Rv, обработанная с помощью ультразвукового диспергатора мощностью 100 Вт при 22 кГц в течение 40 циклов по 1 минуте. Используют супернатант после центрифугирования (18 тысяч об/мин - 30 мин), обработанный ультразвуком биомассы (соникат) [2].
Планшеты, содержащие разведенную венозную кровь, инкубируют при температуре 37°С в атмосфере 100% влажности и 5% СО2 в СО2-инкубаторе в течение 48 часов. По истечении времени инкубации надосадочную жидкость собирают и используют для определения ИФН- с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с применением 2-х моноклональных антител к ИФН- в авидин-биотиновой системе (тест-система "гамма-Интерферон-ИФА-Бест", Новосибирск), согласно прилагаемой инструкции [5]. Учет реакции проводится путем измерения оптической плотности исследуемых образцов на иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм и построения калибровочной кривой по результатам титрования стандартного раствора ИФН- . У каждого пациента определяют 2 показателя: спонтанную продукцию в лунках без добавления стимулятора и индуцированную антигеном H37Rv в лунках с добавлением стимулятора. Рассчитывают показатель , представляющий собой разность между индуцированной и спонтанной продукцией ИФН- . При значениях от 60 до 1400 пг/мл диагностируют активный туберкулез, а при значениях от 0 до 50 пг/мл - отсутствие активности туберкулезного процесса, интервал значений от 50 до 60 пг/мл требует повторного проведения исследования или применения других методов. Всего обследовано 12 больных активным туберкулезом легких и 13 лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких. Активность процесса у лиц с бессимптомным течением туберкулеза подтверждена обнаружением микобактерий туберкулеза или динамикой рентгенологической картины. Результаты исследований представлены в таблице 1 и 2.
Таблица 1 | ||||||
Уровень спонтанной и индуцированной антигеном H37Rv продукции ИФН- у больных активным туберкулезом легких. | ||||||
Пациенты | Уровень ИФН- в супернатантах крови (пг/мл) | |||||
Спонтанно | В ответ на H37Rv | H37Rv | ||||
1.С. | 40 | 1400 | 1360 | |||
2.Ч. | 40 | 500 | 460 | |||
3.А. | 50 | 130 | 80 | |||
4.Ф. | 55 | 55 | 0 | |||
5.С. | 30 | 110 | 80 | |||
6.Г. | 80 | 80 | 0 | |||
7.Т. | 20 | 45 | 25 | |||
8.Е. | 40 | 750 | 710 | |||
9.С. | 40 | 100 | 60 | |||
10.М. | 40 | 140 | 100 | |||
11.Х. | 110 | 180 | 70 | |||
12.П. | 300 | 450 | 150 | |||
Таблица 2 | ||||||
Уровень продукции ИФН- у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких | ||||||
Пациенты | Уровень ИФН- в супернатантах крови (пг/мл) | |||||
Спонтанно | В ответ на антиген H37Rv | H37Rv | ||||
1.Ш. | 20 | 20 | 0 | |||
2.И. | 50 | 50 | 0 | |||
3.Ч. | 20 | 40 | 20 | |||
4.С. | 20 | 50 | 30 | |||
5.Х. | 40 | 80 | 40 | |||
6.Я. | 40 | 40 | 0 | |||
7.С. | 0 | 20 | 20 | |||
8.Л. | 70 | 80 | 10 | |||
9.К. | 20 | 40 | 20 | |||
10.П. | 30 | 30 | 0 | |||
11.А. | 40 | 90 | 50 | |||
12.М. | 50 | 50 | 0 | |||
13.П. | 30 | 30 | 0 | |||
( H37Rv - разность между индуцированной и спонтанной продукцией ИФН- ). |
Получена достоверно более интенсивная продукция ИФН- в ответ на стимуляцию антигеном H37Rv у лиц с бессимптомным и ограниченным, но активным туберкулезом легких по сравнению с лицами, имеющими зажившие посттуберкулезные изменения в легких.
Пример 1.
Больная Ч.А. - 50 лет, находилась на стационарном лечении в Саратовском областном противотуберкулезном диспансере с диагнозом: Очаговый туберкулез 1-2 сегмента левого легкого в фазе инфильтрации МБТ-. Выявлена по обращению с жалобами на сухой кашель, слабость, потерю в весе. Имела массивный семейный контакт с больными туберкулезом сыном и дочерью. При объективном исследовании изменений по органам не установлено. Рентгенологически в 1-2 сегментах левого легкого выявлена группа очаговых теней мелких и средних размеров с нечеткими контурами, слабой интенсивности. Проводилось иммунологическое обследование. Спонтанная продукция ИФН- в супернатанте 48-часовой культуры разведенной венозной крови составила 40 пг/мл, индуцированная антигеном H37Rv - 500 пг/мл, H37Rv - 460 пг/мл.
Пример 2.
Пациентка С., 42-х лет. В настоящее время жалоб не предъявляет. При очередном флюорографическом исследовании в верхней доле левого легкого (1-2 сегмент) выявлена группа мелких очаговых теней средней интенсивности, в окружающей легочной ткани линейные тени, обусловленные ограниченным фиброзом. В прошлом, в 1983 году болела инфильтративным туберкулезом верхней доли левого легкого. Получала антибактериальное лечение с положительным клинико-рентгенологическим эффектом. Предшествующая рентгенологическая документация не сохранилась. С целью уточнения активности выявленных изменений проводилось иммунологическое обследование. Спонтанная продукция ИФН- в супернатанте 48 часовой культуры венозной крови равна 0 пг/мл, индуцированная антигеном H37Rv 20 пг/мл, H37Rv 20 пг/мл. Окончательный диагноз: Плотные очаги. Фиброз.
Остаточные изменения в легочной ткани считаются неактивными, данная пациентка не нуждается в проведении антибактериальной терапии.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить скрытую активность туберкулезного процесса и отличить активные изменения в легких, требующие длительной антибактериальной терапии от неактивных посттуберкулезных изменений в легких. Полезность предложенного метода заключается в возможности быстро, в течение 3-х дней, определить активность туберкулеза легких и своевременно решить вопрос о необходимости лечения. Это позволит предотвратить прогрессирование патологического процесса у активных больных и в то же время избавит лиц с неактивными изменениями в легких от необоснованной 3-месячной химиотерапии, что будет иметь медицинский и экономический эффект.
Источники информации
1. Авербах М.М., Гергерт В.Я. Иммунологическая диагностика // В кн. Туберкулез органов дыхания. / Под ред. А.Г.Хоменко. - М.: Медицина, 1988. - С.167-177.
2. Владимирский М.А. Иммунологические и биотехнологические методы в повышении эффективности диагностики и лечения туберкулеза: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук - М., 1993. - 48 с.
3. Гавриленко B.C. Критерии клинического излечения туберкулеза легких. - М.: Медицина, 1977. - 150 с.
4. Применение новых иммунологических методов при туберкулезе. М.М.Авербах, В.И.Литвинов, В.Я.Гергерт и др.: Методические рекомендации ЦНИИТ АМН России. - М., 1992. - 42 с.
5. Инструкция по применению набора реагентов А-8752 "Гамма-Интерферон-ИФА-Бест" ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск. Лицензия №42/055/2001.
Класс G01N33/68 с использованием протеинов, пептидов или аминокислот