штамм гриба phoma glomerata - продуцент полисахарида, обладающего иммуномодулирующей активностью

Формула изобретения

Штамм гриба Phoma glomerata (хранится в КММ ТИБОХ №4632) - продуцент полисахарида, обладающего иммуномодулирующей активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма гриба - продуцента полисахарида, обладающего иммуномодулирующей активностью.

Известен бактериальный штамм Mycobacterium bovis BCG, продуцирующий иммуномодулирующий полисахарид [Dinadayala P, Lemassu A, Granovski P, Cerantola S, Winter N, Daffe M. Revisiting the structure of the anti-neoplastic glucans of Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin. Structural analysis of the extracellular and boiling water extract-derived glucans of the vaccine substrains // J Biol Chem. 2004. Vol.279. №13. P.12369-78]. Недостатком известного штамма является низкий выход целевого продукта.

В качестве прототипа выбран известный продуцент полисахарида - 1,3- -D-глюкана, обладающего иммуномодулирующей активностью, штамм гриба Ganoderma lucidum CCRC 36123, поскольку этот штамм, как и заявляемый штамм, получают в культуре [Fan-Chiang Yang, Yn-Fuu Ke, Shanq-Shin Kuo Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures // Enzyme and Microbial Technology. 2000. Vol.27. P.295-301]. К недостаткам известного штамма можно отнести его низкую продуктивность в отношении биологически активного полисахарида - 182 мг/л среды.

В связи с тем что грибные полисахариды, относящиеся к группе глюканов, обладают иммуномодулирующими свойствами и поэтому представляют значительный интерес как перспективные иммуномодуляторы, ставится задача получения продукта с более высоким выходом.

Поставленная задача решена выявлением нового штамма гриба Phoma glomerata, продуцирующего полисахарид, обладающий иммуномодулирующей активностью.

Штамм Phoma glomerata выделен из морской лилии (Crinoidea), собранной на глубине 82 м возле острова Кунашир (Курильские острова).

Штамм Phoma glomerata хранится в Коллекции Морских Микроорганизмов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (официальный акроним KMM и номер 644 во Всемирной коллекции культур - WFCC) и ему присвоен коллекционный номер KMM 4632.

Штамм Phoma glomerata KMM 4632 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные и морфологические признаки.

Колонии гриба при выращивании на овсяном агаре быстро растущие, за 7 суток роста достигают 6,5 см в диаметре, колонии с обильным воздушным мицелием, войлочные, сначала белые, с возрастом темно-серые, с темно-оливковыми, почти черными секторами, обратная сторона колонии темно-серая, до черной. Пикниды от округлых до грушевидных, 80-310 мкм в диаметре, одиночные. Стенки пикнид черные, состоят из 4-5 слоев клеток угловатой структуры. Конидии от овальных до эллипсоидных, некоторые слегка изогнуты, 3,8-9×1,5-3 мкм, прозрачные, с возрастом культуры становятся коричневыми. Хламидоспоры многоклеточные, альтернариоидные, темно-коричневые, 30-70×15-150 мкм.

Колонии гриба при выращивании на среде «сусло-агар на натуральной морской воде» серые, темно-серые до черных. Реверзум черный. Микроскопические признаки те же, что и на среде «овсяной агар».

Физиолого-биохимическая характеристика штамма.

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 30°С (28-32°С), алкалофилен, оптимальные значения рН для роста и образования полисахаридов 7,8-8,2.

Способен ассимилировать глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, ксилозу, D-манит, сорбит, сорбозу, рибозу.

Образует N-ацетил- -D-гексозаминидазу, однако не образует хитиназ.

Способ и условия хранения штамма.

Штамм хранится под минеральным маслом на среде «картофельно-морковный агар, приготовленный на натуральной морской воде», при комнатной температуре и естественной влажности при условии пересева не реже, чем раз в четыре года, с пассированном на среде «сусло-агар с натуральной морской водой».

Новый штамм продуцирует полисахарид, обладающий иммуномодулирующими свойствами с выходом 245±12 мг на 1 л питательной среды «Тубаки» и 328±24 мг/л питательной среды «жидкое сусло на морской воде». Полисахарид представляет собой 1,3; 1,6- -D-глюкан с молекулярной массой 110 kDa.

Технический результат штамма гриба Phoma glomerata KMM 4632 заключается в его более высокой продуктивности. Продуктивность этого штамма в два раза превосходит продуктивность известного грибного штамма G.Lucidum. Кроме того, преимуществом заявляемого штамма по сравнению с прототипом является то, что для его выращивания требуется среда с меньшим числом компонентов и, что особенно важно, на 40% меньшим расходом сахаров (состав среды для выращивания G.lucidum, г/л: глюкоза, 50,0; К₂HPO₄ 0,5; КН₂PO₄ 0,5; MgSO₄ 7H₂O 0,5; дрожжевой экстракт 1,0; хлорид аммония 4,0). В случае культивирования штамма на среде «сусло-агар на натуральной морской воде» сахар не требуется. Затраты на сахара составляют основную статью расходов на выращивание культур в промышленных масштабах. Таким образом, производство штамма гриба Phoma glomerata KMM 4632 с экономической точки зрения более выгодно по сравнению с производством штамма - прототипа.

Новый штамм может использоваться для промышленного получения полисахарида, обладающего иммуномодулирующей активностью.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Phoma glomerata KMM 4632 выращивают методом глубинного культивирования на питательной среде следующего состава, г/л натуральной морской воды (в трипликате): глюкоза 30; пептон 1; дрожжевой экстракт 0,5; КН₂PO ₄ 1; MgSO₄ 7Н₂ O 0,5; FeSO₄ 7H₂O 0,02 (рН 7,8-8,2). Культивирование осуществляют при 22°С в колбах на качалке 180-200 об/мин в течение 168 часов.

Затем биомассу из культуральной жидкости (1 л) отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин и экстрагируют 200 мл дистиллированной воды при кипячении в течение 2 часов, после осаждения неэкстрагированного продукта центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин, целевой полисахарид осаждают 3 объемами 95% спирта. Выход полисахарида после высушивания составляет 245±12 мг.

Пример 2. Штамм Phoma glomerata KMM 4632 выращивают методом глубинного культивирования на питательной среде «жидкое сусло на морской воде» следующего состава: сусло пивное неохмеленное, разбавленное натуральной морской водой до 4 градусов по Баллингу (рН 7,8-8,2). Культивирование осуществляют при 22°С в колбах на качалке 180-200 об/мин в течение 168 часов.

Биомассу из культуральной жидкости (1 л) отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин и экстрагируют 200 мл дистиллированной воды при кипячении в течение 2 часов, после осаждения неэкстрагированного продукта центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин, целевой полисахарид осаждают 3 объемами 95% спирта. Выход полисахарида после высушивания составляет 328±24 мг.

Полисахарид, продуцируемый штаммом Phoma glomerata KMM 4632, был исследован на наличие иммуномодулирующей активности в сравнении со стандартным индуктором липополисахаридом Escherichia coli (LPS).

Данные сведены в таблицу.

Таблица Иммумодулирующая активность полисахарида, усиление синтеза фактора некроза опухоли-альфа (TNF) и NO-синтазной активности (NOS) клетками периферической крови человека
Индуктор, 1 мкг/мл	Индекс усиления продукции ФНО (TNF)	Индекс усиления NOS
LPS	2,2±0,1	3,0±0,2
Полисахарид (пример 1)	2,2±0,1	2,3±0,2
Полисахарид (пример 2)	2,5±0,1	2,5±0,1