штамм бактерий paenibacillus campinasensis - продуцент циклодекстринглюканотрансферазы

Формула изобретения

Штамм бактерий Paenibacillus campinasensis, Коллекция микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН ИБ-10155 - продуцент бета-циклодекстринглюканотрансферазы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения препаратов циклодекстринглюканотрансферазы (ЦГТаз К.Ф.2.4.1.19), фермента для получения циклодекстринов из крахмала.

В частности, изобретение относится к технологии бета-циклодекстринглюканотрансферазы (бета-ЦГТазы), трансформирующей крахмал преимущественно в бета-циклодекстрин. Этот циклический олигосахарид наиболее востребован в пищевой, фармакологической, текстильной промышленности, косметике и др. [1-3]

ЦГТазы катализируют образование одновременно трех макроциклических олигосахаридов (или циклодекстринов, отличающихся своими молекулярными размерами и свойствами. Бета-циклодекстрин состоит из семи остатков альфа-D-глюкозы, в то время как альфа- и гамма- макроциклические гомологи имеют в кольцах своих молекул шесть и восемь глюкопиранозных звеньев. Из-за универсальной способности образовывать комплексы включения с целым спектром органических и неорганических соединений бета-циклодекстрин востребован на рынке и промышленно выпускается в больших объемах [4].

Сырьем для получения циклодекстринов является крахмал, а в результате реакции образуется смесь альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов, а также смесь линейных и разветвленных декстринов различного молекулярного размера. Выход и соотношение количества синтезированных индивидуальных циклических олигосахаридов зависит от каталитических свойств использованной ЦГТазы.

Имеющаяся информация о продуцентах и каталитических свойствах ЦГТаз и, в частности бета-ЦГТаз, не позволяет провести их объективное сравнение потому, что эти анализы были выполнены в неидентичных условиях и разных лабораториях. Между тем, характер и глубина реакции ферментативной трансформации крахмала в циклодекстрины существенно зависят от многих составляющих: природы и источника крахмала, соотношения в нем амилопектина и амилозы, режима предобработки крахмала перед ферментативной реакцией, от рН среды, температуры, дозировок фермента и др. Объективная сравнительная информация о каталитических свойств различных препаратов ЦГТаз также не может быть получена из-за ограниченной доступности как образцов ферментов, так и их продуцентов, отсутствия методических стандартов при измерении циклизующей активности. Тем не менее, среди главных критериев, определяющих эффективность продуцентов бета-ЦГТаз, находятся: селективность ЦГТазы в отношении синтеза бета-ЦД, общий выход бета-ЦД, их термостабильность.

Известны штаммы бактерий вида Paenibacillus macerans (устаревшее название Bacillus macerans) и Bacillus sterothermophilus, образующие ЦГТазы, катализирующие образование, преимущественно, альфа-циклодекстрина [3]. В процессах получения бета-циклодекстринов эти ферменты могут использоваться лишь в технологии с использованием органических сольвентов, зачастую весьма токсичных, таких, например, как толуол [3, 5]. Бета-циклодекстрин, полученный в контакте с толуолом, не отвечает современным требованиям экологической безопасности конечного продукта.

Известны штаммы Bacillus sp., Bacillus circulans и Bacillus alkalophilus, [3, 5, 6], для которых характерно образование бета-специфичных ЦГТаз, катализирующих главным образом синтез бета-циклодекстрина в сумме трех макроциклических олигосахаридов. Бета-ЦГТазы также отличаются более глубокой степенью (по сравнению с ЦГТазами Paenibacillus macerans) транс-трансформации крахмала в циклические продукты. Названные культуры как продуценты ЦГТ-аз приемлемы для процессов получения бета-циклодекстрина по бессольвентной технологии.

Наиболее близким аналогом по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Bacillus sp.(депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКМ Б-1793Д), образующий внеклеточную бета-ЦГТазу, основным продуктом которой при воздействии на крахмал является бета-циклодекстрин [7].

Недостатком ЦГТазы, продуцируемой культурой, является ее сравнительно низкая термостабильность.

Другим недостатком бета-ЦГТазы штамма Bacillus sp ВКМ Б-1793Д является то, что доля бета-циклодектрина в сумме других циклических олигосахаридов непрерывно меняется процессе ферментативной реакции. Выраженное непостоянство в соотношении между циклодекстринами в конверсионной смеси приводит к технологической нестабильности на стадии выделения и очистки конечного продукта - кристаллического бета-циклодекстрина.

Задачей, на решение которой было направлено заявляемое изобретение, являлся поиск природного штамма, обеспечивающего синтез внеклеточной бета-ЦГТАзы, обладающей достаточной термостабильностью, катализирующий реакцию трансформации крахмала в бета-ЦД при относительном постоянстве доли этого продукта в сумме других циклических декстринов на разных стадиях реакции.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обнаружении культуры микроорганизмов, обладающих способностью к образованию ЦГТазы, пригодной для синтеза бета-циклодекстрина при температуре не менее 55°С и катализирующей реакцию трансформации крахмала до получения конверсионной смеси при относительном постоянстве доли бета-ЦД.

Сущность объекта изобретения - штамм Paenibacillus campinasensis ИБ-10155.

Новый штамм ИБ-10155 выделен из образца почвы, отобранного в Кармаскалинском районе (д.Старо-Мусино) Республики Башкортостан, путем микроаэрофильной накопительной культуры на элективной питательной среде, содержавшей минеральные буферные компоненты и циклодекстрин в качестве единственного источника углерода и энергии.

Морфологические признаки штамма. Клетки палочковидные, размером 0,3-0,6·2-3,5 мкм через 24 ч инкубации при 37°С подвижные, грамвариабельные. Образуют эндоспоры. Спорообразование терминальное и субтерминальное, споры эллиптические, спорангий раздувающий.

Штамм при росте на мясопептонном агаре (МПА) через сутки при 37°С образует плоские полупрозрачные колонии размером в диаметре 3-5 мм с ровным краем и гладкой поверхностью, с консистенцией сливочного масла. На влажном картофельно-глюкозном агаре при упомянутых выше условиях штамм формирует плоские, неправильной формы и размером 5-10 мм, прозрачные, беловатого цвета мигрирующие колонии, большинство из которых обладает нечетко оформленным центром с радиально мигрирующими микроколониями. Описанный характер роста колоний нарушается при использовании подсушенного агара или при температуре выше 45°С. В жидком мясопептонном бульоне культура образует слизь. Как в жидкой, так и на плотной среде культура не образует пигментов.

Биохимические признаки штамма

Аэроб, но способен к аноксическому росту в присутствии нитратов.

Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) отрицательная, рН в бульоне Фогес-Проскауэра после роста <6 (5,95).

Реакция на каталазу суточной культуры положительная.

Штамм образует кислоту (но не газ) из глюкозы, ксилозы, арабинозы и маннита. Способен к сбраживанию этих сахаров при посеве уколом в столбике агара.

Гидролизует (вызывает деполимеризацию) крахмал, казеин и слабо желатин.

Не утилизирует цитрат, тирозин и фенилаланин.

Мочевину не разлагает, индол не образует. Восстанавливает нитраты до нитритов.

Штамм способен к росту в питательном бульоне с 7% NaCl. Хорошо растет в интервале рН 7,4-10,0 с оптимумом 9-9,5.

Температурный интервал для роста 20-46°С с оптимумом 38-40°С.

Штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре 5-10°С на картофельно-глюкозном (или картофельном) агаре не менее 6 месяцев с обязательным пересевом не реже 1 раза в 3 месяца.

Филогенетические характеристики штамма.

Сравнение последовательности 1484 нуклеотидов участка гена, кодирующего 16S рРНК, штамма ИБ-10155 выявило 99,7% сходство с участком аналогичной последовательности (номер последовательности в Генбанке AF021924), обнаруженной ранее у типового штамма Paenibacillus campinasensis, депонированного в Корейской коллекции типовых культур КСТС под номером 0364BP^T.

На основании изучения совокупности морфологических, биохимических и филогенетических характеристик описываемой культуры новый штамм, продуцирующий бета-ЦГТазу, был идентифицирован как Paenibacillus campinasensis ИБ-10155.

Для роста культуры и биосинтеза бета-циклодекстринглюканотрансферазы источником углерода могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, кукурузная и другая зерновая мука, отходы производства кукурузы, картофель, или же их экстракты. Источниками азота могут служить пептон, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, дрожжевые клетки, аммонийный азот. В качестве минеральных добавок может использоваться двузамещенный фосфат калия, сода, карбонат кальция.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в ферментере или колбах при температуре 40°С в течение 64-72 часов, рН среды 8-9,5. В процессе культивирования осуществляется контроль за активностью бета-ЦГТазы в культуральной жидкости.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Иллюстрируется возможность получения жидкого ферментного препарата бета-ЦГТазы путем культивирования патентуемого штамма в колбах на качалках с последующим сгущением ферментационной жидкости на модуле ультрафильтрации.

Посевной материал получают выращиванием штамма на твердой питательной среде состава: крахмал растворимый 1%; пептон 0,4%, дрожжевой экстракт 0,5%, фосфат калия двузамещенный 0,2, карбонат натрия 0,3% агар 1,6%, рН среды 8,6-9,0. Колбы с жидкой средой того же состава, но не содержащей агара, инокулируют биомассой отдельных колоний. Культивирование проводят в 250 мл колбах, содержащих 60 мл стерильной среды, на качалке с 240 об/мин при 40°С в течение 64-72 часов.

Активность бета-ЦГТазы в культуральной жидкости и количество единиц фермента при дозировании определяют по способности исследуемого препарата катализировать образование бета-циклодекстрина из 2% раствора крахмала. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при 50°С катализирует образование 1 мкМ бета-ЦД из 2% картофельного крахмала. Ферментативную реакцию осуществляют смешиванием двух объемов 3%-го свежеприготовленного растворимого картофельного крахмала в 0,1 М ацетатном буфере при рН 5,7 с одним объемом раствора фермента (КЖ), разбавленным ацетатным буфером в 50-400 раз. Пробирку с реакционной смесью термостатируют в течение 60 минут при 50°С в твердотельном термостате. Порцию реакционной смеси в объеме 500 мкл добавляют к 3000 мкл измерительного раствора, приготовленного на основе 0,1 М углекислого калия и 0,4% спиртового фенолфталеина. Полученный раствор перемешивают и определяют поглощение полученной смеси D₁ при 553 нм в стеклянной кювете с длиной оптического пути 1 см. Концентрацию фенолфталеина в измерительном растворе подбирают таким образом, чтобы в момент определения активности оптическая плотность этой жидкости составляла величину E₅₅₃=1,00±0,1. Контролем служит проба смеси фермента с крахмалом, идентичная той, что была использована в опыте, но не прошедшая 1 часовую термическую обработку при 50°С. Порцию жидкости контрольного образца смешивают с измерительным раствором, аналогично тому, как это было сделано с реакционной смесью, после чего проводят измерение оптической плотности полученной контрольной смеси D₂ при 553 нм. Активность фермента определяют по формуле (I):

где D₅₅₃=(D₂-D ₁) - разность оптической плотности между измеряемым и контрольным растворами;

N - степень разбавления фермента.

Средние величины бета-ЦГТазной активности патентуемого штамма и других циклодекстриногенных микроорганизмов, использованных с целью сравнения, измеренные в культуральной жидкости через 70 часов роста, даны в таблице 1.

Средняя активность бета-ЦГТазы Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 в бесклеточной культуральной жидкости составляет величину 5,8±1,0 ед/мл.

Пример 2. В сопоставимых условиях измерений, демонстрируются каталитические особенности бета-ЦГТазы Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 в сравнении с действием бета-циклизующих ферментов из других продуцентов (таблица 1).

Опыт выполняют следующим образом. В пластиковые пробирки объемом 5 мл помещают по 2 мл 4% картофельного крахмала в 50 мМ ацетатном буфере рН 6,0, подвергнутого 30 минутному автоклавированию при 120°С. В эти же пробирки дозируют порции растворов бета-ЦГТаз, полученных из различных источников, чтобы достичь соотношения 1, 2, 4, 8, 15, 30 ед. бета-ЦГТазы на 1 г АСВ крахмала в пробирке. Туда же также вводят порции консерванта, предотвращающего микробный рост. Для выравнивания концентрации субстрата (крахмала) до 2,75% по АСВ во все пробирки добавляют расчетные порции 50 мМ ацетатного буфера рН 6,0. Через 24 часа экспозиции при 50°С из полученных растворов отбирают по 900 мкл жидкости, которую смешивают со 90 мкл 10 мас.% ксилозы (внутреннего стандарта), с 990 мкл ацетонитрила. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и далее супернатант анализируют методом ВЭЖХ на колонке с аминированным силикагелем. В качестве элюэнта используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 60:40. Концентрацию циклодекстринов в пробах рассчитывают методом внутреннего стандарта по площадям пиков программно-аппаратными средствами. Выход ЦД в опытах, характеризовавшихся максимальным выходом суммы циклических продуктов, а также другие расчетные параметры, определенные в этом примере, также представлены в таблице 1.

Пример 3. Демонстрируется устойчивость ЦГТазы Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 к термическому воздействию в сравнении с ферментами других продуцентов.

Опыт выполняют с использованием образцов препаратов ЦГТаз, разбавленных 50 мМ ацетатным буфером при рН 6,0 до удельной активности 1,0 ед/мл, без добавления стабилизаторов (солей кальция). Пробирки с одинаковыми объемами разведении исследуемого фермента 1000 мкл помещают в твердотельный термостат и инкубируют при 55°С. Через определенные интервалы времени термообработанные образцы извлекают и измеряют в них остаточную бета-ЦГТазную активность согласно процедуре, описанной в примере 1. Время инактивации 50% активности ферментных препаратов различных продуцентов в условиях настоящего опыта, измеренное методом графической экстраполяции и интерполяции, представлено в таблице 1.

Пример 4. Демонстрируется относительное постоянство доли бета-циклодекстрина на разных стадиях ферментативного воздействия при обработке крахмала ферментом в сравнении с ЦГТазой Bacillus sp. BKM Б-1793Д в условиях избыточных дозировок ферментов.

В два стеклянных реактора объемом 200 мл, снабженных устройствами перемешивания и термостатирования, вносят раствор картофельного крахмала, подвергнутого 30 минутной обработке при 120°С, и ацетат натрия. В реакторы добавляют образцы лиофильно высушенных ферментных препаратов бета-ЦГАаз Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 и Bacillus sp. BKM Б-1793Д. Дозировку ферментов подбирают по количеству субстрата, внесенного в реактор, при этом она составляет 30 ед. бета-ЦГТазы на 1 грамм АСВ крахмала. В реактор также добавляют 50 мМ ацетатный буфер для достижения требуемых концентраций ингредиентов, которые составляют: по крахмалу 2,75 мас.% (по АСВ), по ацетату натрия - 50 мМ. Стартовое значение рН смеси должно составлять величину 6,00±0,05. Через определенные промежутки времени из реактора извлекают объемы жидкости, останавливают в них ферментативную реакцию добавлением 50 об.% ацетонитрила и измеряют концентрацию циклодекстринов методом ВЭЖХ, как это описано в примере 2. Результаты определения, показанные в таблице 2, свидетельствуют о том, что при использовании ЦГТазы патентуемого штамма Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 (в сравнении с циклизующим ферментом штамма-прототипа Bacillus sp. BKM Б-1793Д) наблюдается более высокий выход суммы циклических продуктов по отношению к крахмалу при относительном постоянстве доли бета циклодекстрина в продуктах конверсии.

Таблица 1 Результаты конверсии раствора 2,75% (АСВ) картофельного крахмала препаратами бета-ЦГТаз в сопоставимых условиях.
Номер штамма в коллекции ИБ УНЦ РАН	Название	Активность ЦГТазы ВКЖ Ед/мл	% конверсии в циклические продукты	Время потери 50% активности ЦГТазы при 55°С, мин	% бета-ЦД в продуктах конверсии	Выход ЦД по отношению к АСВ субстрату, мас.%
						альфа-ЦД	бета-ЦЦ	гамма-ЦД
10116	Bacillus sp.	1.0	51.0	9	71.0	10.0	36.0	5.0
10167	Bacillus sp.	3.9	90.0	19	60.0	23.0	54.0	13.0
10115	Paenibacillus sp.	0.35	50.0	6	31.3	30.0	15.7	4.3
10169	Bacillus sp.	1.29	74.5	11	71.6	11.4	53.4	9.8
10199	Bacillus sp.	0.44	73.2	6	57.9	23.7	42.4	7.2
10192	Bacillus sp.	0.61	62.0	12.4	68.9	10.9	42.7	8.4
10195	Bacillus sp.	3.9	86.7	46	61.0	18.1	52.9	15.8
10168	Bacillus sp.	5.8	94.4	19	62.4	20.3	58.9	15.2
10176	Paenibacillus sp.	0.43	77.5	161	65.0	16.3	50.4	10.8
10162	Paenibacillus sp.	0.39	79.6	89	67.7	14.5	53.8	11.2
10181	Paenibacillus sp.	0.67	68.8	120	75.0	7.5	51.6	9.7
10155	Paenibacillus campinasensis	5.8	74.6	325	73.9	8.5	55.1	11.0
663	Bacillus sp.ВКМБ Б-1793Д	2.9	68.0	9	67.4	14.5	45.8	7.7

Таблица 2 Конверсия крахмала по действием ЦГТазы Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 и Bacillus sp. BKM Б-1793Д в бета-циклодекстрин.
Время, ч	ЦГТаза Bacillus sp.BKM Б-1793Д			ЦГТаза Paenibacillus campinasensis ИБ-10155
	Доля бета ЦД в циклических продуктах реакции, мас.%	Выход бета-ЦД к крахмалу, мас.%	Конверсия крахмала в ЦД, мас.%	Доля бета ЦД в циклических продуктах реакции, мас.%	Выход бета-ЦД к крахмалу, мас.%	Конверсия крахмала в ЦД, мас.%
1	73	32	44	77	29	38
2	71	39	55	75	41	53
4	69	45	65	74	52	70
8	67	45	68	74	55	75
15	63	41	66	71	53	69
20	60	40	63	71	51	68
30,5	57	34	58	71	49	65

Источники информации

1. Szente L., Szejtli J. Cyclodextrins as food ingredients. Trends in Food Science & Technology (2004), v15, p.137-142.

2. Szeitli J. Cyclodextrins in the Textile Industry. Starch/Starke (2003) v.55 p.191-196.

3. Циклодекстрины // Под ред. Егорова Н.С. - Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия Микробиология. - 1988-1989. - Т.20-21.

4. Абелян В.А. Циклодекстрины: Получение и применение. Изд. Дом "Ван-Арьян", Ереван, 2001, 519 с.

5. Szeitli J. Cyclodextrin technology. Kluwer academic publishers, 1989. 450 p.

6. Патент России N2244742, кл. С12N 1/20, 2000.

7. Авторское свидетельство SU 1738852 A1, кл. С12N 9/10, 1990.