способ продуцирования 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов

Формула изобретения

1. Способ продуцирования 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="/images/patents/156/2311009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновой кислоты формулы II

-карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="/images/patents/156/2311461/2311461-6.gif" BORDER="0" TI="CF" HE="56" WI="59">

где R₁ выбран из группы, состоящей из Н, ОН, R-C(O)O-, -CH₂ОСН ₃, СН₃СН(OR)O-;

R представляет собой С₁-С₈алкильную группу;

R₂ выбран из Н, F, Cl, Br и СН₃-;

R₃ представляет собой Н или СН₂=;

R ₄ представляет собой -СН₂ОН или -СН ₃, путем грибкового окисления 6-замещенного- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="/images/patents/156/2311022/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнана формулы I

-карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="/images/patents/156/2311461/2311461-7.gif" BORDER="0" TI="CF" HE="56" WI="59">

где R₁ выбран из группы, состоящей из Н, ОН, R-C(O)O-, -СН₂OCH ₃, СН₃СН(OR)O-;

R представляет собой С₁-С₈алкильную группу;

R₂ выбран из Н, F, Cl, Br и СН₃-;

R₃ представляет собой Н или СН₃=;

R ₄ представляет собой -СН₂ОН или -СН ₃,

R₅ представляет собой -СНО, -CH₂OH или -СН₃,

включающий приведение в контакт 6-замещенного- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="/images/patents/156/2311022/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнана формулы I с биотрансформационной средой, содержащей вид рода Nigrospora, способный окислять углерод в 19-м положении 6-замещенного- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="/images/patents/156/2311022/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнана формулы I, где биотрансформационная среда содержит от приблизительно 0,1 мл/л до приблизительно 4 мл/л неионного детергента и от приблизительно 5 г/л до приблизительно 60 г/л источника углерода, выбранного из групп, состоящих из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, гидролизованных полисахаридов и сахарных спиртов.

2. Способ по п.1, где вид рода Nigrospora выбран из Nigrospora sphaerica АТСС 12772, Nigrospora gorlenkoanum ATCC 24718 и Nigrospora oryzae ATCC 42775.

3. Способ по п.2, где вид рода Nigrospora представляет собой Nigrospora sphaerica ATCC 12772.

4. Способ по п.2, где вид рода Nigrospora представляет собой Nigrospora gorlenkoanum ATCC 24718.

5. Способ по п.2, где вид рода Nigrospora представляет собой Nigrospora oryzae ATCC 42775.

6. Способ по п.1, где R₅ представляет собой -СНО.

7. Способ по п.1, где R ₅ представляет собой -СН₂ОН.

8. Способ по п.1, где R₅ представляет собой -СН₃.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к грибковому окислению 6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы 1 с образованием 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновых кислот формулы II с последующей стадией химического декарбоксилирования с получением 19-нор-6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы III.

Предшествующий уровень техники

19-Нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион (номегестрол) и родственные молекулы формулы III представляют собой полезные стероидные промежуточные соединения для синтеза фармакологически активных 19-нор-стероидов. Например, 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион (номегестрол) может быть использован для синтеза ацетата номегестрола (19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион 17 ацетата), стероида женского здоровья.

Известен (патент Соединенных Штатов 4284720) способ получения 19-гидрокси-стероидов из соответствующих 10-метил-стероидов андостанового или прегнанового ряда путем ферментации культурой гриба рода Nigrospora.

19-Нор-стероиды химически синтезировали из 19-гидрокси-стероидов.

Заявленный способ позволяет осуществить ферментативное окисление 6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы I сразу до 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновых кислот.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В целом, в настоящем изобретении предложен практический способ грибкового окисления 6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы I с образованием 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновых кислот формулы II с последующей стадией химического декарбоксилирования с получением 19-нор-6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы III.

Способ продуцирования 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновой кислоты формулы II,

-карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" TI="CF" HE="56" WI="59">

где R₁ выбран из группы, состоящей из Н, ОН, R-C(O)O-, -СН₂OCH ₃, СН₃СН(OR)O-;

R представляет собой С₁-С₈алкильную группу;

R₂ выбран из Н, F, Cl, Br и СН₃-;

R₃ представляет собой Н или СН₂=;

R ₄ представляет собой -СН₂OH или -СН ₃,

путем грибкового окисления 6-замещенного- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнана формулы I,

-карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" TI="CF" HE="56" WI="59">

где R₁ выбран из группы, состоящей из Н, ОН, R-C(O)O-, -СН₂OCH ₃, СН₃СН(OR)O-;

R представляет собой С₁-С₈алкильную группу;

R₂ выбран из Н, F, Cl, Br и СН₃-;

R₃ представляет собой Н или СН₂=;

R ₄ представляет собой -СН₂OH или -СН ₃,

R₅ представляет собой -СНО, -СН₂ОН или СН₃,

включающий

приведение в контакт 6-замещенного- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнана формулы 1 с биотрансформирующей культурой, содержащей вид рода Nigrospora, способный окислять углерод в 19-ом положении 6-замещенного- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнана формулы I.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ниже приведены определения и объяснения терминов, используемых по всему этому документу, включая как описание изобретения, так и формулу изобретения.

Все температуры даны в градусах Цельсия.

"Об/мин" обозначает обороты в минуту.

"ТСХ" обозначает тонкослойную хроматографию.

"ВЭЖХ" обозначает высокоэффективную жидкостную хроматографию.

"psig" (pounds per square inch gage) обозначает размерность давления в фунтах на квадратный дюйм.

"ОО" обозначает обратный осмос.

Когда используют смеси растворителей, отношения используемых растворителей даны в единицах объем/объем (об./об.).

Когда используют растворимость твердого вещества в растворителе, отношение твердого вещества к растворителю дано в единицах масса/объем (мас./об.).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В общем, данное изобретение относится к грибковому окислению 6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы I,

-карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" TI="CF" HE="56" WI="59">

где R₁ выбран из группы, состоящей из Н, ОН, R-C(O)O-, -CH₂OCH ₃, СН₃СН(OR)O-;

R представляет собой C₁-С₈алкильную группу;

R₂ выбран из Н, F, Cl, Br и СН₃-;

R₃ представляет собой Н или СН₂=;

R ₄ представляет собой -CH₂OH или -СН ₃,

R₅ представляет собой -СНО, -CH₂OH или СН₃,

с получением 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновых кислот формулы II,

-карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" TI="CF" HE="56" WI="59">

где R, R₁, R ₂, R₃, R₄ являются такими же, как и R, R₁, R ₂, R₃, R₄ в формуле I.

Любой нитевидный гриб рода Nigrospora, способный окислять углерод в 19-ом положении 6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы I, может быть использован для продуцирования 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновых кислот формулы II. Методику, приведенную в Примере 1, можно использовать для того, чтобы определить, способен ли конкретный нитевидный гриб рода Nigrospora окислять углерод в 19-ом положении 6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы I.

19-Нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновые кислоты формулы II затем могут быть выделены и подвергнуты химическому декарбоксилированию с получением 19-нор-6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы III,

-карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" TI="CF" HE="56" WI="59">

где R, R₁, R ₂, R₃, R₄ являются такими же, как и R, R₁, R ₂, R₃, R₄ в формуле I.

Авторами изобретения обнаружено, что приведение в контакт 6-замещенных- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁶-прегнанов формулы I с определенными штаммами Nigrospora, в частности Nigrospora sphaerica ATCC 12772, Nigrospora gorlenkoanum ATCC 24718 и Nigrospora oryzae ATCC 42775, давало 19-нор-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновые кислоты формулы II.

В способе по настоящему изобретению биотрансформационная среда содержит поверхностно-активное вещество и высокий уровень источника углерода. Поверхностно-активное вещество выбрано из группы неионных детергентов, включающих неионные амиды, неионные сложные эфиры, такие как этоксилированные алкилфенолы и сложные эфиры полиоксиэтилен-сорбитана, эмульгирующие воска, неионные этоксилаты, тристирилфенолэтоксилаты, спиртовые этоксилаты, такие как октилфеноксиполиэтоксиэтанол, этоксилированные меркаптаны, блокированные (capped) этоксилаты, блоксополимеры и обратные сополимеры.

Предпочтительно, в качестве поверхностно-активных веществ используют этоксилированные алкилфенолы, сложные эфиры полиоксиэтилен-сорбитана или октилфеноксиполиэтоксиэтанол. Используемая концентрация неионного детергента может составлять от приблизительно 0,1 мл/л или 0,1 г/л до приблизительно 4 мл/л или 4 г/л, но обычно от приблизительно 1 мл/л или 1 г/л до приблизительно 2 мл/л или 2 г/л.

Источник углерода выбран из групп, состоящих из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, гидролизованных полисахаридов и сахарных спиртов. Обычно в качестве источника углерода используют глюкозу. Концентрация источника углерода может составлять от приблизительно 2 г/л до приблизительно 100 г/л, но обычно от приблизительно 5 г/л до приблизительно 60 г/л.

Предпочтительно, гриб выращивают в глубинной культуре в аэробных условиях с использованием любой методики, известной в данной области техники, а окислительную реакцию осуществляют in situ. Желательный гриб Nigrospora культивируют с использованием условий, способов, источников углерода и источников азота, известных специалистам в данной области техники. В общем, для грибкового 19-окисления при получении используют методику первичного и вторичного вегетативных посевов. Альтернативно, первичный вегетативный посев можно использовать непосредственно для инокуляции биотрансформационной среды для грибкового 19-окисления.

Первичные вегетативные посевные культуры инкубируют в течение периода от приблизительно 24 до приблизительно 96 часов (предпочтительно около 48-72 часов) при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 37°С (предпочтительно около 28°С) и рН от приблизительно 3,0 до приблизительно 7,5. Вторичную вегетативную посевную среду инокулируют от приблизительно 0,006% до приблизительно 0,25% [об./об.] первичной вегетативной посевной культурой, но обычно от приблизительно 0,012% до приблизительно 0,1% [об./об.] и инкубируют в течение периода от приблизительно 36 до приблизительно 72 часов (предпочтительно около 48-60 часов) при температуре от приблизительно 20°С до приблизительно 37°С (предпочтительно около 28°С). Значение рН вторичной посевной среды может составлять от приблизительно 3,0 до приблизительно 7,5, но предпочтительно от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0. Биотрансформационную среду, которая может быть такой же или подобной вторичной вегетативной посевной среде, инокулируют от приблизительно 1% до приблизительно 10% [об./об.] вторичной вегетативной посевной культурой (предпочтительно от приблизительно 3% до приблизительно 5%). После периода начальной инкубации от приблизительно 12 до приблизительно 72 часов (предпочтительно от приблизительно 16 до приблизительно 24 часов) к биотрансформирующей культуре добавляют стероидные субстраты формулы I, предпочтительно микронизированные. Микронизированные стероидные субстраты формулы I можно добавлять в виде сухого порошка или водной суспензии, либо в виде однократной добавки или серии добавок, либо путем непрерывной подачи. Предпочтительно использовать микронизированные стероидные субстраты формулы I в концентрации выше 1 г/л, более предпочтительно выше 2 г/л, еще более предпочтительно выше 4 г/л. Биотрансформации стероидных субстратов формулы I с образованием 19-окисленных продуктов формулы II дают осуществиться в течение от приблизительно 1 до приблизительно 9 суток, но обычно от приблизительно 2 до приблизительно 6 суток. Превращение можно контролировать хроматографическим способом, таким как ВЭЖХ, известным специалистам в данной области техники. Подходящий способ ВЭЖХ предложен в примере 1.

Сразу после завершения биотрансформации стероидных субстратов формулы I до 19-окисленных продуктов формулы II соединения формулы II можно выделить с использованием любой методики из ряда известных в данной области техники. Предпочтительно, исчерпанную ферментационную среду, цельную или отфильтрованную, экстрагируют органическим растворителем, не смешивающимся с водой, таким как метиленхлорид, снижая рН до тех пор, пока продукт формулы II не окажется в форме кислоты. Не смешивающийся с водой органический растворитель затем концентрируют упариванием. Продукт формулы II затем экстрагируют в воду, повышая рН до тех пор, пока продукт формулы II, представляющий собой карбоновую кислоту, не будет ионизирован (рН от 8 до 9). Этот водный экстракт разбавляют смешивающимся с водой растворителем, таким как метанол, и рН снижают до тех пор, пока продукт формулы II вновь не перейдет в форму кислоты (рН от 3 до 4). Неочищенный продукт формулы II медленно кристаллизуют путем выпаривания смешивающегося с водой растворителя.

Стероидные соединения формулы II могут быть подвергнуты химическому декарбоксилированию с получением стероидных соединений формулы III. Стадию декарбоксилирования осуществляют с использованием условий и реагентов, известных, специалистам в данной области техники. В общем, соединения формулы II растворяют в полярном растворителе вместе с кислотным катализатором. Смесь нагревают для осуществления желаемого декарбоксилирования. Обычно карбоновую кислоту обрабатывают каталитическим количеством соляной кислоты в водном метаноле при кипячении с обратным холодильником в течение 30 минут для осуществления желаемого декарбоксилирования. Однако растворитель и кислота не являются важными. Подходит любой растворитель, который будет растворять как субстрат карбоновую кислоту, так и кислотный катализатор. Предпочтительные растворители включают пиридин, пиколин, диметилсульфоксид (ДМСО), гексаметилфосфорамид (НМРА), сульфолан, диметилформамид, диметилацетамид, N-метилпирролидон, ацетонитрил, ацетон, метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол или их водные смеси. Метанол является наиболее предпочтительным растворителем. Соединения формулы II растворяют в концентрации от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 500 мг/мл (предпочтительно около 100-300 мг/мл).

Подходящим кислотным катализатором является кислота, которая имеет рКа менее 4,9. Такие кислоты включают соляную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, ледяную уксусную кислоту, фосфорную кислоту, бензолсульфоновую кислоту, бромуксусную кислоту, хлоруксусную кислоту, лимонную кислоту, дихлоруксусную кислоту, щавелевую кислоту, трифторуксусную кислоту и трихлоруксусную кислоту. Конечная концентрация кислоты в метаноле составляет от 0,001 н. (рН 3) до 0,1 н. (рН 1), предпочтительно около 0,01 н. (рН 2). Реакционную среду нагревают до температуры от 40°С до 80°С (предпочтительно около 50-60°С) в течение от приблизительно 1 часа до приблизительно 24 часов (предпочтительно от 4 до 12 часов). Соединения формулы III можно выделить из этой реакционной смеси с использованием любой методики из ряда известных в данной области техники; предпочтительной методикой является кристаллизация путем концентрирования упариванием и/или охлаждения.

Декарбоксилирование также можно осуществить в две стадии: первая, декарбоксилирование с получением 3-кето- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁵⁽¹⁰⁾-промежуточного соединения, с последующей стадией изомеризации до соединения (III). Декарбоксилирование до 3-кето- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁵⁽¹⁰⁾-промежуточного соединения можно осуществить путем перемешивания в ДМСО при комнатной температуре (15-25°С) в течение 16 часов. 3-Кето- -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ⁵⁽¹⁰⁾-промежуточное соединение затем подвергают изомеризации до соединения III путем обработки кислотой, имеющей рКа менее 4,9, как описано выше.

ПРИМЕРЫ

Без дополнительного уточнения считается, что специалист в данной области техники может, используя предшествующие описания, применить настоящее изобретение в его наиболее полной степени. Следующие подробные примеры описывают как получить различные соединения и/или осуществить различные способы по данному изобретению и их следует истолковывать как только иллюстративные и никак не ограничивающие предшествующее описание каким-либо образом. Специалисты в данной области техники сразу узнают подходящие отклонения от этих методик как в отношении реагирующих веществ, так и в отношении условий реакции и методик.

ПРИМЕР 1

Превращение 4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона в 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновую кислоту осуществляют с использованием глубинной культуры Nigrospora sphaerica ATCC 12772 с последующим декарбоксилированием до 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона.

(А) Стадия первичного посева

Замороженные вегетативные клетки Nigrospora sphaerica ATCC 12772 оттаивают, переносят на чашки с картофельным агаром с декстрозой (PDA) и инкубируют при 28°С в течение 72 часов. Для инокуляции силиконизированных встряхиваемых колб на 500 мл с делениями, содержащих 100 мл первичной посевной среды, используют одиночные мицелиальные пробки (6-7 мм в диаметре). Первичная посевная среда состоит из (на литр OO воды) декстрина, 50 г; соевой муки, 35 г; глюкозы, 5 г; гексагидрата хлорида кобальта, 2 мг; кремнийорганического пеногасителя (SAG 471), 0,5 мл; рН предварительной стерилизации 7,0-7,2 доводили гидроксидом натрия (2 н.). Встряхиваемые колбы, содержащие первичную посевную среду, стерилизуют в течение 30 минут при 121°С с использованием автоклава. Nigrospora sphaerica АТСС 12772 инкубируют в течение 48 часов при 28°С, используя инкубатор-шейкер с контролируемыми условиями, установленный на 270 об/мин (2''-орбитальный ход).

(Б) Стадия вторичного посева

Сто миллилитров вторичной посевной среды в силиконизированных встряхиваемых колбах на 500 мл с делениями инокулируют, используя 0,2 мл вегетативной первичной посевной культуры (0,2% [об./об.] процент инокуляции). Вторичная посевная среда содержит (на литр OO воды) глюкозу, 30 г; соевую муку, 12,5 г; твердый кукурузный экстракт, 10 г; октилфеноксиполиэтоксиэтанол, 0,25 мл; кремнийорганический пеногаситель (SAG 471), 0,5 мл; рН предварительной стерилизации 6,5-6,6 доводили гидроксидом натрия (2 н.). Встряхиваемые колбы, содержащие вторичную посевную среду, стерилизуют в течение 30 минут при 121°С с использованием автоклава. Nigrospora sphaerica АТСС 12772 инкубируют в течение приблизительно 52 часов при 28°С, используя инкубатор-шейкер с контролируемыми условиями, установленный на 270 об/мин (2''-орбитальный ход).

(В) Биотрансформация стероидов

Сто миллилитров среды для биотрансформации стероидов в силиконизированных встряхиваемых колбах на 500 мл с делениями инокулируют, используя 5 мл вегетативной вторичной посевной культуры (5% [об./об.] процент инокуляции). Среда для биотрансформации стероидов по существу является такой же, как и вторичная посевная среда, за исключением того, что содержание октилфеноксиполиэтоксиэтанола увеличено от 0,25 мл/л до 2 мл/л. Приблизительно через 22 часа после инокуляции к 100 мл ферментационной среды добавляют 0,5 г микронизированного 4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона, суспендированного в минимальном объеме 0,2% [об./об.] октилфеноксиполиэтоксиэтанола.

Биотрансформирующие культуры ежедневно анализируют на 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновую кислоту с использованием ВЭЖХ. Один миллилитр цельной исчерпанной ферментационной среды экстрагируют 3 мл теплого ацетонитрила. Клетки отделяют от водно-ацетонитрильной смеси путем центрифугирования (3000×g в течение 10 минут) и 5 мкл экстракта вводят в колонку для ВЭЖХ. Условия для ВЭЖХ являются следующими: хроматограф Spectra-Physics, оснащенный С18 обращенно-фазовой колонкой (150×4,6 мм); температура колонки 30°С; подвижная фаза (изократическая), ацетонитрил/0,25% фосфорная кислота (55/45, [об./об.]); скорость потока = 0,5 мл/мин; детекция, 287 нм; время проскока = 20 минут. Биотрансформация 4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона до 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновой кислоты завершается приблизительно через 2 суток.

(Г) Методика выделения и декарбоксилирования

Цельную исчерпанную ферментационную среду от пяти 100-мл ферментации при сборе экстрагируют 250 мл метиленхлорида, снижая рН до 4. Барду повторно экстрагируют дополнительными 200 мл метиленхлорида. Обогащенные метиленхлоридные экстракты выделяют путем центрифугирования и затем объединяют, очищают и концентрируют упариванием приблизительно до 50 мл. Продукт (19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновую кислоту) затем экстрагируют в 50 мл воды, повышая рН до 9. Этот обогащенный водный экстракт разбавляют 50 мл метанола и рН снижают до 4. Неочищенный продукт кристаллизуют выпариванием метанола. Твердые вещества выделяют из водной суспензии путем фильтрации, промывают 15 мл воды и сушат с получением 1,22 г неочищенной кристаллической 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновой кислоты.

1,22 г неочищенной 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновой кислоты растворяют в 4 мл метанола, содержащего 0,1 мл 85%-ной фосфорной кислоты, и реакционную смесь нагревают до 55°С. Реакционную смесь анализируют каждый час на 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион, используя ВЭЖХ. Пять микролитров реакционной смеси разбавляют в 1 мл ацетонитрила и 5 мкл вводят в колонку для ВЭЖХ. Условия для ВЭЖХ такие же, как описано выше. Декарбоксилирование 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновой кислоты до 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона завершается приблизительно через 4 часа. Реакционную смесь охлаждают до -10°С, а кристаллы отфильтровывают и промывают 1 мл метанола при -10°С с получением 0,72 г 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона 99,4% чистоты.

ПРИМЕР 2

Превращение 4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона в 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновую кислоту осуществляют, используя глубинную культуру Nigrospora gorlenkoanum ATCC 24718, с последующим декарбоксилированием до 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона.

При условиях, описанных в ПРИМЕРЕ 1, получили 1,18 г неочищенной кристаллической 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновой кислоты. Это вещество затем превращали с получением 0,75 г 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона 99,7% чистоты.

ПРИМЕР 3

Превращение 4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона в 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновую кислоту осуществляют, используя глубинную культуру Nigrospora oryzae ATCC 42775, с последующим декарбоксилированием до 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона.

При условиях, описанных в ПРИМЕРЕ 1, получили 1,20 г неочищенной кристаллической 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-дион-10 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -карбоновой кислоты. Это вещество затем превращали с получением 0,65 г 19-нор-4,6-прегнадиен-6-метил-17 -карбоновых кислот путем грибкового окисления 6-замещенных- ⁶-прегнанов, патент № 2311461" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ол-3,20-диона 99,2% чистоты.