способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием

Формула изобретения

Способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием, характеризующийся тем, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом -токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе, добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии, проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано при производстве лекарственных средств, корригирующих иммунную и гепатобилиарную системы организма.

Известен способ получения лецитин-холестериновых липосом, обладающих антиэкссудативной активностью, мембрана которых содержит дополнительное количество ненасыщенных жирных кислот [см. Е.М.Бородулина, В.М.Крейнес. Усиление антиэкссудативной активности липосом с помощью ненасыщенных жирных кислот // Патологич. физиология и эксперим. терапия. 1996 N3. М., Медицина, с. 18-20].

Однако в известном способе не выявлено влияние полученных липосом на иммунную и гепатобилиарную системы организма.

Известен способ получения липосом, изготавливаемых из лецитинов растительного и животного происхождений и смеси кислых (соевых) фосфолипидов, пригодных для инкапсулирования лекарств (цитостатиков, иммуномодуляторов, полиненасыщенных жирных кислот из морских животных, обладающих кардиопротекторными, антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами) [Способ получения липосом. Патент РФ 02071765, опубл. 20.01.1997 г.].

Однако недостатком известного способа является то, что полученные средства используются только в качестве носителей лекарственных препаратов и биологически активных веществ, не обладают каким-либо самостоятельным биологически активным действием и применяются только для парентерального введения в организм, в то время как не была изучена их активность при пероральном введении.

Известен способ получения липосом, содержащих биологически активные вещества (негормональные противовоспалительные средства и др.), а также противовирусные и противогрибковые агенты [см. Liposomes containing biologically active compounds. EP 1515698 A2 N03761255. 23.03.2005].

Однако недостатком известного способа является то, что полученные липосомальные средства обладают только анальгетическими, противовоспалительными, противобактериальными и противовирусными свойствами, тогда как не было выявлено их иммунобиологическая и гепатопротекторная активность.

Известен способ получения липосом из яичных фосфолипидов, включающий экстракцию суммарных фосфолипидов из яичных желтков, растворение яичных фосфолипидов в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя яичных фосфолипидов в круглодонной колбе на роторном испарителе, добавление буферного раствора, встряхивание смеси, обработку смеси ультразвуком, центрифугирование смеси и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости [см. Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж.Б.Финдлея, У.Г.Эванза. - М.: Мир, 1990, с.188-195].

Недостатком данного способа является то, что полученные липосомы используются только в качестве носителей лекарственных препаратов и не обладают каким-либо самостоятельным фармакологическим воздействием.

Известен способ получения липосом из яичных фосфолипидов, включающий экстракцию суммарных фосфолипидов из яичных желтков, растворение смеси яичных фосфолипидов и жира байкальской нерпы в соотношении 4:6 в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя яичных фосфолипидов в круглодонной колбе на роторном испарителе, добавление раствора, содержащего 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер, 0.001 М ЭДТА, рН 7.4, встряхивание смеси до получения однородной суспензии на механической качалке в течение 30 минут, обработку смеси в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц, центрифугирование смеси в течение 90 минут при 105000 g и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости [см. Способ получения липосом. Патент РФ №2153328, опубл. 27.07.2000 г., Бюл. №21].

Полученные по известному способу липосомы обладают иммунокорригирующими свойствами, тогда как не выявлено их влияние на гепатобилиарную систему организма.

Задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в изменении фармакологических свойств липосом.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, - это создание липосомального средства, обладающего гепатопротекторными свойствами с высокими иммунокорригирующими свойствами.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что известный способ характеризуется тем, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом -токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе, добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии, проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости.

Байкальская нерпа - эндемик уникального озера Байкал, относится к отряду ластоногих семейства настоящих тюленей. В данное время нерпа - важнейший объект зверобойного промысла, добывается с единственной целью получения меха животного, а жир и другие виды тканей (в том числе и печень), в лучшем случае направляются на зверофермы для откорма животных либо на техническую переработку [В.Д.Пастухов Нерпа Байкала. - Новосиб.: ВО Наука. 1993, 271 с.].

Как известно, основную массу покровных жиров морских млекопитающих составляют простые липиды - триацилглицериды. Исследования химического состава жира выявили 60 жирных кислот, содержащих от 8 до 22 углеродных атомов. Из них на долю насыщенных кислот приходится 17-19%, мононенасыщенных 59-60%, полиненасыщенных 22-23% (в том числе диеновых 6.1-7.0%, триеновых 0.2-0.3%, тетраеновых 3.9-4.1%, пентаеновых 4.6-5.0%, гексаеновых 6.2-7.0%). Высокая биологическая ценность жира нерпы обусловлена в основном содержанием таких высоконенасыщенных кислот, как экозапентаеновой (2.65%) и докозагексаеновой (6.28%). Эти кислоты являются предшественниками особых гормоноподобных веществ - простагландинов и тромбоксанов. В результате исследований фракционного состава жира нерпы было показано, что доминирующей фракцией являются триацилглицериды (до 99%). Свободные жирные кислоты, эфиры стеаринов находятся в следовых количествах (до 0.2%). Количество неомыляемых соединений не превышает 0.3%, остальные 0.5% приходятся на сумму ди- и моноглицеринов. Витамины А, Д, К в жире нерпы не обнаружены. Токоферолы содержатся в следовых количествах.

Жирнокислотный состав липидов печени байкальской нерпы включает в себя более 25-и полиненасыщенных жирных кислот с длиной цепи более 14-и углеродных атомов, наиболее распространенными из которых являются олеиновая - 18:1n-9 (11.62%), линолевая - 18:2n-6 (4.31%), эйкозадиеновая - 20:2n-6 (1.55%), дихомо-гамма-линоленовая - 20:3n-6 (1.12%), арахидоновая - 20:4n-6 (20.15%), эйкозапентаеновая - 20:5n-3 (0.44%), докозагексаеновая - 22:6n-3 (6.73%). Анализ жирнокислотного состава липидов печени нерпы показал, что содержание насыщенных, мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот практически одинаково и составляет 31.85%, 33.15% и 35.70% соответственно. При этом соотношение жирных кислот семейств омега-6/омега-3 составляет 3.19:1, что позволяет отнести печень байкальской нерпы к числу перспективных источников сырья для использования в пищу и использования в качестве БАВ.

Преимуществом жира, содержащегося во внутренних органах, перед покровным, является наличие в нем фосфолипидов. Как показали исследования, содержание фосфолипидов в печени нерпы составило 4.7% от сухого остатка. Среди фосфолипидов в печени байкальской нерпы преобладают по количеству фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин (41.07% и 37.22% по отношению к общему количеству фосфолипидов соответственно) [Кабирова И.Р. Характеристика и промышленное использование печени байкальской нерпы на пищевые цели. Дисс...к.т.н. - Улан-Удэ, 2005. - 107 с.].

Соотношение фосфолипидов печени нерпы и жира нерпы подбирали таким образом, чтобы обеспечить максимальное иммунокорригирующее действие.

Иммунокорригирующую активность изучали в реакциях, ответственных за клеточный (в реакциях «трансплантат против хозяина» - РТПХ и гиперчувствительность замедленного типа - ГЗТ) и гуморальный иммунитет (в реакции антителообразования).

Эксперименты проводились на мышах обоего пола линии F1 (СВАхС57В1/6), а также линии СВА массой 20-22 г. В работе были исследованы: 1) липосомы, приготовленные на основе яичных фосфолипидов с добавлением жира нерпы в соотношении 4:6; 2) липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира нерпы в соотношениях 4:6 и 6:4; 3) липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы. Препараты вводились экспериментальным животным ежедневно перорально в течение 14 дней в объеме 0.2 мл. Действие экстракта было изучено на животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, которое вызывали введением азатиоприна в концентрации 50 мг/кг, что вызывало угнетение показателей клеточного и гуморального иммунитета.

Использование липосом, содержащих разные соотношения фосфолипидов печени нерпы и жира нерпы, на фоне иммунной супрессии восстанавливало показатель РТПХ лабораторных животных до уровня интактных. Несколько больший (на 5-10%) по сравнению с остальными группами индекс реакции был отмечен в группе животных, получавших липосомы, содержащие фосфолипиды печени и жир нерпы в соотношении 4:6 (см. табл. 1).

Таблица 1 Изменение показателя реакции «Трансплантат против хозяина» у мышей, получавших липосомальные средства
Группа животных	Индекс увеличения лимфоузлов
Интактные	2.51±0.11
Азатиоприн, 50 мг/кг	1.24±0.06*
Азатиоприн + липосомы Я/Ж (4:6)	2.4±0.08**
Азатиоприн + липосомы П/Ж (4:6)	2.42±0.14**
Азатиоприн + липосомы П/Ж (6:4)	2.30±0.07**
Азатиоприн + липосомы П	2.46±0.12**
Примечания (к табл. 1-4): 1. липосомы Я/Ж (4:6) - липосомы, приготовленные на основе яичных фосфолипидов с добавлением жира нерпы в соотношении 4:6;

2. липосомы П/Ж (4:6) и (6:4) - липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира нерпы в соотношениях 4:6 и 6:4; 3. липосомы П - липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы; 4. * - достоверное отклонение результатов по сравнению с группой интактных животных (р<0.05); 5. ** - достоверное отклонение результатов по сравнению с группой животных «Азатиоприн» (р<0.05); 6. *** - достоверное отклонение результатов по сравнению с группой животных «Азатиоприн + липосомы Я/Ж» (р<0.05).

Использование всех исследуемых липосомальных средств восстанавливало показатель клеточноопосредованной реакции ГЗТ лабораторных животных, находившихся в состоянии иммунной супрессии, до уровня показателя ГЗТ у интактных животных, причем максимальное значение индекса достигало в группе, получавшей липосомы, полученные на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира в соотношении 4:6 (см. табл.2).

Таблица 2 Изменение индекса реакции ГЗТ под воздействием липосомальных средств
Группа животных	Индекс реакции, %
Интактные	27.29±0.78
Азатиоприн, 50 мг/кг	14.54±1.88*
Азатиоприн + липосомы Я/Ж (4:6)	30.39±1.90**
Азатиоприн + липосомы П/Ж (4:6)	31.85±2.52**
Азатиоприн + липосомы П/Ж (6:4)	24.4±1.85**
Азатиоприн + липосомы П	27.23±1.52**
Примечания: (см. табл.1).

Как показали результаты исследования, липосомы на основе фосфолипидов печени с добавлением жира нерпы, взятых во всех изучаемых соотношениях, проявляли большую активность по сравнению с липосомами на основе яичных фосфолипидов и липосомами на основе только фосфолипидов печени нерпы на фоне иммунодепрессии и вызывали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 10⁶ спленоцитов; при этом показатели антителообразующей активности клеток селезенки подопытных животных восстанавливались до уровня интактных животных (см. табл.3).

Таблица 3 Количество антителообразующих клеток у животных под воздействием липосомальных средств
Группа животных	Число АОК на селезенку	Число АОК на 10 6 спленоцитов
Интактные	40042±2367	673.2±42.5
Азатиоприн, 50 мг/кг	16375±1451*	271.5±28.1*
Азатиоприн + липосомы Я/Ж (4:6)	33761±1493**	516.0±73.2**
Азатиоприн + липосомы П/Ж (4:6)	46705±1284**, ***	721.0±62.3 **, ***
Азатиоприн + липосомы П/Ж (6:4)	44167±2055** , ***	677.5±54.6** , ***
Азатиоприн + липосомы П	34500±3500**	521.7±33.5**
Примечания: (см. табл.1).

Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальным соотношением: фосфолипиды печени нерпы: жир нерпы, при котором наблюдалось максимальное иммуностимулирующее действие, является 4:6.

Изучение иммунобиологической активности липосом, полученных предложенным способом, проводили на мышах обоего пола линии F1 (СВАхС57В1/6) со средней массой тела 20-22 грамма в реакции фагоцитоза Staphylococcus aureus перитонеальными макрофагами in vitro по методике И.С.Фрейдлин [И.С.Фрейдлин. Использование культуры мышиных перитонеальных макрофагов в качестве моделей для изучения клеток мононуклеарной фагоцитарной системы организма и их применение под влиянием биологически активных веществ // Метод, рекоменд. - Л., 1976]. В реакции фагоцитоза подсчитывали два показателя: активность (процент фагоцитирующих клеток от общего числа сосчитанных макрофагов) и интенсивность (среднее количество микроорганизмов, поглощенное одной клеткой). Подавление функций макрофагов моделировали введением классического иммунодепрессанта азатиоприна в концентрации 500 мкг/мл в культуральную среду. Действие азатиоприна вызывало снижение активности фагоцитоза на 50%, интенсивности фагоцитоза интактных макрофагов - на 48.25%. Липосомы вводили в среду с иммуносупрессированными клетками в концентрации 200 мкг/мл (в пересчете на жир нерпы). Анализ полученных данных показал, что введение в данном опыте липосом, полученных предложенным способом, на фоне предварительного воздействия азатиоприном достоверно превышало оба показателя и восстанавливало их до уровня интактных (см. табл.4).

Таблица 4 Показатели фагоцитоза Staphylococcus aureus перитонеальными макрофагами мышей in vitro при воздействии липосомальных средств, полученных на основе фосфолипидов печени нерпы
Группы животных	Активность фагоцитоза	Интенсивность фагоцитоза
Контроль (интактные клетки)	64.16±5.36	12.58±1.08
Азатиоприн, 500 мкг/мл	35.29±1.12*	6.51±0.32*
Азатиоприн + липосомы П/Ж (4:6)	63.23±4.18**	12.35±1.09**
Примечания: (см. табл.1).

Согласно этим данным можно сделать вывод о стимулирующем действии полученных липосом на фагоцитарную активность макрофагов in vitro.

Гепатопротекторную активность липосом, полученных предложенным способом, изучали на крысах-самцах линии Wistar с исходной массой 180-200 г. Липосомальные средства на основе фосфолипидов печени нерпы вводили перорально в объеме 0.5 мл/200 г массы крысы 1 раз в сутки в течение 7-и, 14-и и 21-го дня. Соответствующие контрольные группы животных в аналогичных условиях получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме. Действие липосомальных средств на основе фосфолипидов печени нерпы было изучено на животных с токсическим гепатитом. Токсический гепатит вызывали подкожным введением крысам 50%-ного масляного (V/V) раствора тетрахлорметана (CCl₄) в объеме 0,4 мл на 100 г веса, 1 раз в сутки, в течение четырех дней. В качестве препарата сравнения был использован «Холосас», рекомендуемый при заболеваниях гепатобилиарной системы в качестве желчегонного средства [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Изд-во Новая волна», 2005. - 1200 с.]. «Холосас» вводили крысам с CCl ₄ -гепатитом в объеме 0,1 мл на 100 г массы. Желчь для исследования получали в условиях острых опытов под наркозом (0,1 мл внутрибрюшинно 25% водного раствора тиопентала-натрия).

Оценку желчевыделительной функции печени проводили по скорости секреции желчи [Скакун Н.П., Олейник А.Н. Сравнительное действие атропина и метацина на внешнесекреторную функцию печени // Фармакология и токсикология. - 1967. - Т.30. - №3. - С.334-337] (см. табл.5).

Таблица 5 Влияние липосом на основе фосфолипидов печени байкальской нерпы на скорость секреции желчи у белых крыс при токсическом гепатите, вызванном тетрахлорметаном (ТХМ)
Условия опыта	Скорость секреции желчи в течение 4-х часов, мг/мин на 100 г
	1 ч	2 ч	3 ч	4 ч
Интактные животные	6.6±0.1	6.4±0.2	5.7±0.08	5.3±0.5
7 сутки
Контроль (ТХМ)	5.4±0.1	5.1±0.2	5.1±0.05	3.3±0.0
ТХМ + Холосас	5.6±0.4	6.3±0.6*	5.9+0.4*	4.1±0.4*
ТХМ + Липосомы	6.5±0.2* , **	6.9±0.2*	6.6±0.4*	6.0±0.4* , **
14 сутки
Контроль (ТХМ)	4.4±0.03	4.0±0.03	3.3±0.0	3.3±0.3
ТХМ + Холосас	7.1±0.1*	6.5±0.1*	5.1+0.3*	4.8±0.3*
ТХМ + Липосомы	7.4±0.1*	6.6±0.08*	6.0±0.1*, **	5.3±0.1*, **
21 сутки
Контроль (ТХМ)	5.7±0.2	5.4±0.4	5.0±0.3	4.6±0.3
ТХМ + Холосас	6.0±0.3	5.6±0.2	5.4±0.4	4.7±0.2
ТХМ + Липосомы	7.6±0.6* , **	6.9±0.4* , **	5.4±0.2	5.0±0.3
Примечание (к табл. 5 и 6): * - достоверное отклонение значения относительно контрольного значения в соответствующие сроки эксперимента; ** - достоверное отклонение значения относительно значения в группе животных, получавших «Холосас», в соответствующие сроки эксперимента.

В процессе экспериментальной фармакотерапии токсического гепатита липосомами, приготовленными заявляемым способом, наблюдали ускорение желчевыделительной функции печени крыс (табл.5). На ранних сроках эксперимента (7-й день) у крыс, получавших липосомы, скорость секреции желчи возрастала по сравнению с животными контрольной группы на 20.4%, 35%, 29% и в 2 раза в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й часы наблюдения соответственно. На 14-й день опыта под влиянием липосом скорость секреции желчи возрастала в 1.6 раза (после 1-го, 2-го и 4-го часа опыта) и в 1.8 раза (после 3-го часа опыта) по сравнению с контролем. На 21-й день опыта у крыс, получавших испытуемые липосомы, скорость секреции желчи возрастала умеренно. Так, через 1 час после их введения скорость секреции желчи увеличилась на 33%, а через 2 часа - на 27% по сравнению с контролем; тогда как через 3 и 4 часа после введения липосом существенной разницы в скорости выделения желчи у животных не наблюдалось. Необходимо отметить, что в некоторые сроки эксперимента скорость выделения желчи у животных, принимавших липосомы, была достоверно выше таковой у животных, получавших фармакопейное средство «Холосас».

Оценку желчеобразовательной функции печени производили по общему количеству выделенной желчи, концентрации желчных кислот [Карбач Я.И. Количественное определение желчных кислот в желчи и крови с применением хроматографического метода // Биохимия. - 1961. - Т.26. - №2. - С.305-309]. Концентрацию холестерина в желчи определяли по методу [Дроговоз С.М. Нарушение интенсивности желчеотделения и химического состава желчи при дистрофии печени, вызванной четыреххлористым углеродом // Вопросы медицинской химии. - 1971. - Вып.4. - С.397-400], билирубина - по методу [Скакун Н.П. Нейрогуморальный механизм желчегонного действия инсулина. // Проблемы эндокринологии. - 1956. - №6. - С.75-78].

Биохимические показатели секретируемой желчи подопытных животных представлены в табл. 6, из которой следует, что при введении животным липосом общее количество желчи, выделенное за 4 часа (весь период наблюдения), повышалось на 8.3% (после 7-и суток), на 68.7% (после 14-и суток) и на 20.3% (после 21-х суток) по сравнению с контролем в соответствующие сроки эксперимента. Необходимо отметить, что по данному показателю активность липосом была достоверно выше, чем у «Холосаса». Наряду с ускорением холереза под влиянием липосом отмечены позитивные изменения и в химическом составе желчи. Так, концентрация общих желчных кислот в секретируемой желчи повышалась с 7-х суток наблюдения и превышала таковую в контроле на 58% (так же как и на 14-е сутки), а на 21-е сутки - на 72%; содержание билирубина повышалось на 20% (на 7-е и 14-е сутки) и на 85% (на 21-е сутки эксперимента). При этом количество холестерина оставалось на одном и том же уровне на 7-е сутки, на 14-е сутки уменьшалось на 18%, а на 21-е сутки увеличивалось в 4 раза (см. табл.6).

Таблица 6 Влияние липосом на основе фосфолипидов печени байкальской нерпы на биохимический состав желчи у белых крыс при токсическом гепатите, вызванном тетрахлорметаном (n=5)
Условия опыта	Общее количество желчи, выделенное за 4 часа	Содержание желчных кислот	Содержание билирубина	Содержание холестерина
1	2	3	4	5
	мг/100 г	Мг %
Интактные животные	1440±54	62.7	20	5.15
7 сутки
Контроль (ТХМ)	1134±24	54.15	5	11.55
ТХМ + Холосас	1314±118*	48.45	6	10.4
ТХМ + Липосомы	1560±148*	85.5	6	12.25
14 сутки
Контроль (ТХМ)	900±19	57	5	9.9
ТХМ + Холосас	1410±51*	85.5	6	9.85
ТХМ + Липосомы	1518±26* , **	85.5	6	8.1
21 сутки
Контроль (ТХМ)	1242±81	62.7	7	0.8
ТХМ + Холосас	1302±76	96.9	18	1.85
ТХМ + Липосомы	1494±94* , **	108.3	13	3.9
Примечания: (см. табл.5).

По результатам исследований активности липосомального средства, полученного предложенным способом, видно, что оно является корректором иммунной и гепатобилиарной систем организма. Это в свою очередь позволяет предполагать эффективность применения полученного средства при состояниях, сопровождающихся угнетением иммунной системы организма и нарушениями желчеотделительной функции печени.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналогичных технических решений.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям «новизна» и «изобретательский уровень».

Заявляемый способ получения липосом осуществляется следующим образом.

Фосфолипиды по известному способу экстрагируют из печени байкальской нерпы [см. М. Кейтс. Техника липидологии. М.: «Мир», 1975. - 236 с.]. К 6-7 г свежей печени прибавляют 3 мл воды и 30 мл смеси хлороформ-метанол (1:2) и ткань гомогенизируют в гомогенизаторе с ножами [Foss Tecato-2094] в течение 2 мин при комнатной температуре. Гомогенат центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин, супернатант декантируют и остаток реэкстрагируют 38 мл смеси хлороформ-метанол-вода (1:2:0.8) в гомогенизаторе [Foss Tecato-2094] в течение 2 мин. Ткань отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин, объединенные супернатанты разбавляют 20 мл хлороформа и 20 мл воды, водно-метанольную и хлороформную фазу разделяют отстаиванием в делительной воронке. Нижний хлороформный слой концентрируют на роторном испарителе [испаритель ротационный ИР-1М2 ТУ 25-1173.102-84] при 30-35°С. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа. Далее к раствору суммарных липидов в хлороформе приливают пятикратный объем ацетона и смесь выдерживают 2-3 ч при 0°С, выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. С помощью пипетки вносят раствор фосфолипидов печени нерпы, жира байкальской нерпы [ТУ 9281-017-02069473-2001] и антиоксиданта альфа-токоферола [см. М.Д.Машковский. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - 11-е изд. Стер. - М.: Медицина, 1988. - С.37-39] в соотношении 4:6:0.05 (0.1 г смеси) в органическом растворителе (1 мл хлороформа + 1 мл метанола) в толстостенную круглодонную колбу. Испаряют растворитель на роторном испарителе [испаритель ротационный ИР-1М2 ТУ 25-1173.102-84] так, чтобы дать возможность полученной смеси распределиться в виде тонкой пленки по стенке колбы. В колбу добавляют раствор, содержащий 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер; 0.001 М ЭДТА, рН 7.4, встряхивают до получения однородной суспензии на механической качалке [Установка выращивания микроорганизмов, термостатированная УВМТ-12-250] в течение 30 минут. Обрабатывают липидную смесь в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц. Обработанную смесь центрифугируют в течение 90 минут при 105000 g и отбирают верхние три четверти надосадочной жидкости.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о том, что заявляемый способ позволяет получить липосомальное средство, обладающее самостоятельным лечебным - иммунокорригирующим и гепатопротекторным - действием, и расширить сырьевую базу для получения липосом, используя дешевое природное сырье.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».