способ защиты от-пцр от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-днк-гликозилазы

Формула изобретения

Способ защиты от контаминации обратной транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), катализируемой обратной транскриптазой M-MuLV и ДНК-полимеразой, предусматривающий проведение обратной транскриптазной реакции с использованием в качестве дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dTTP, dGTP и dCTP, обработку реакционной смеси перед проведением ПЦР урацил-ДНК-гликозилазой, высвобождающей свободный урацил из урацил-содержащей ДНК при 37°С, и проведение ПЦР с использованием в качестве дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dTTP, dUTP, dGTP и dCTP, отличающийся тем, что обратную транскриптазную реакцию и полимеразную цепную реакцию проводят в одном реакционном объеме, а обработку реакционной смеси урацил-ДНК-гликозилазой проводят на стадии реакции обратной транскрипции, причем указанный фермент добавляют в смесь для обратной транскриптазной реакции.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулярно-генетическим методам детекции биологических объектов.

Контаминация - попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты [1, 2, 3].

Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе детекции из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки [1, 2, 3].

Урацил-ДНК-гликозилазный метод защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации является действенным инструментом, позволяющим значительно снизить риск ложноположительных реакций [1]. Оптимизированные методики с использованием Tth-полимеразы нашли достойное применение в решении данной проблемы. Температурный режим элонгации Tth ДНК полимеразы (60-72°С) позволяет использовать урацил-ДНК-гликозилазный метод защиты от контаминации в варианте «I пробирка, 1 этап» [1].

Использование же M-MuLV обратной транскриптазы совместно с урацил-ДНК-гликозилазой (из Е. coli) [4, 5] в варианте «1 пробирка, 1 этап» невозможна по причине одинаковой рабочей температуры ферментов (37°С).

Цель изобретения - разработка эффективной методики защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе урацил-ДНК-гликозилазного метода защиты.

Нами разработан способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) [4, 5] на урацил-содержащую ДНК в варианте «1 пробирка, 2 этапа» при использовании M-MuLV обратной транскриптазы и Taq ДНК полимеразы путем комбинированного использования dTTP/dUTP.

Принцип способа заключается в том, что на 1 этапе M-MuLV обратная транскриптаза катализирует матричный синтез ДНК на матрице РНК с исключением использования урацил-содержащих ампликонов в качестве матрицы из-за их гидролиза урацил-ДНК-гликозилазой (из Е. coli) при температуре 37°С. В качестве строительных блоков используются dATP, dTTP, dGTP, dCTP. На 2 этапе добавляется в реакционную смесь Taq ДНК полимераза и смесь из дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dUTP, dGTP, dCTP) с заменой dTTP на dUTP в пропорциональной концентрации с общим содержанием во время проведения ПЦР 5 дезоксинуклеозидтрифосфатов -dATP, dTTP, dUTP, dGTP и dCTP, что обеспечивает выход урацил-содержащей ДНК (Схема).

Ближайшим аналогом заявленного способа можно считать способ защиты ОТ-ПЦР, катализируемой обратной транскриптазой M-MuLV и ДНК-полимеразой, от контаминации продуктами амплификации, раскрытый в Instruction manual, DyNAmo^ТМ Capillary SYBR® Green 2-Step qRT-PCR Kit (Distributed by New England Biolabs, Version 1.2, March 2005, www. finnzymes.com) (далее D1). Указанный способ (D1), как и заявленное изобретение, предусматривает:

1) проведение обратной транскриптазной реакции с использованием в качестве дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dTTP, dGTP и dCTP;

2) обработку реакционной смеси урацил-ДНК-гликозилазой, высвобождающей свободный урацил из урацил-содержащей ДНК при 37°С, перед проведением ПЦР;

3) проведение ПЦР с использованием в качестве

дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dTTP, dUTP, dGTP и dCTP.

Заявленный способ отличает от указанного предложения (D1) то, что ПЦР и обратнотранскриптазную реакцию проводят в одном реакционном объеме, причем урацил-ДНК-гликозилазу добавляют в реакционную смесь для обратной транскриптазной реакции.

Условия проведения реакции

Для теоретического обоснования разработанного способа нами были проведены практические исследования, направленные на доказательство эффективности выбранного подхода, для чего проводили мультиплексную ОТ-ПЦР для одновременного выявления возбудителей вирусных болезней картофеля в варианте «1 пробирка, 2 этапа» с использованием в качестве ПКО (положительный контрольный образец) положительную на PVY (Potato vims Y)+PVX (Potato vims X) амплифицированную ОТ-ПЦР-пробу в разведении 1:10000 в смеси с ОКО (отрицательный контрольный образец) по протоколу, представленному в таблице.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (Россия).

Детекцию результатов проводили методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере (ТВЕ), рН 8,0, содержащим этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с визуализацией УФ-светом ( =310 нм).

Размеры амплифицированных фрагментов ДНК в нуклеотидных парах (н.п.) оценивали по подвижности в 2% агарозном геле по сравнению со стандартным маркером размерами 100-1500 н.п.(«СибЭнзим», Новосибирск) (чертеж).

Таблица "Одна пробирка, два этапа" Обратнотранскриптазная реакция
Реактивы		Исходная концентрация		Рабочая концентрация		1 проба		10 проб
dH2O						9,45 мкл		94,5 мкл
Смесь из dATP, dTTP, dGTP, dCTP		2 мМ каждого из dNTP		0,3 мМ		2,25 мкл		22,5 мкл
Буфер ОТ		10×		1×		1,5 мкл		15,0 мкл
M-MuLV Обратная транскриптаза		5 ед		0,5 ед		0,1 мкл		1,0 мкл
Урацил-ДНК-гликозилаза (из E. Coli)		5 ед		0,5 ед		0,1 мкл		1,0 мкл
PPVYCP6P cgtccaaaatgagaatgcc		50 мкМ		0,5 мкМ		0,15 мкл		1,5 мкл
PPVYCP6M tcttgtgtactgatgccac		50 мкМ		0,5 мкМ		0,15 мкл		1,5 мкл
PPVXv1 gacactatggcacaggctgcttgg		50 мкМ		0,5 мкМ		0,15 мкл		1,5 мкл
PPVXc2 ttgggcagcattcatttcagcttc		50 мкМ		0,5 мкМ		0,15 мкл		1,5 мкл
Проба						1,0 мкл
Всего						15,0 мкл
37°С - 45 мин.
Добавить равный объем (15 мкл) ПЦР смеси ПЦР
Реактивы	Исходная концентрация		Рабочая концентрация		1 проба		10 проб
dH2O					11,05 мкл		110,5 мкл
Смесь из dATP, dUTP, dGTP, dCTP	2 мМ каждого из dNTP		0,3 мМ		2,25 мкл		22,5 мкл
Буфер Taq ДНК полимераза	10×		1×		1,5 мкл		15,0 мкл
Taq ДНК полимераза	5 ед		1 ед		0,2 мкл		2,0 мкл
Всего					15,0 мкл

Режим амплификации: 37°С-15 мин. 94°С-4 мин. 94°С - 1 мин, 60°С - 1 мин, 72°С - 1 мин.=40 циклов. 72°С-10 мин.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на теоретическое обоснование разработанного способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из E. Coli), нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в демонстрации предотвращения возможности реамплификации урацил-содержащих ампликонов (чертеж) при использовании заявленного протокола ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка 2 этапа» (таблица) ввиду того, что урацил-содержащая ДНК (контаминант) теряет роль мишени из-за выщепления из нее свободного урацила ферментом урацил-ДНК-гликозилазой (из E. coli) в процессе реакции (Схема).

Источники информации

1. http://www.roche-applied-science.com.

2. Higuchi, R. and Kwok, S. (1989) Nature 339, 237-238.

3. Tomilin, N.V. and Aprelikova, O.N. (1989) Intl. Rev. Cytol. 114, 125-179. 3. Sobek, H. et al. (1996) FEBS Lett. 388, 1^t.

5. Longo, M.C., Beringer, M.S., and Hartle, J.L. (1990) Gene 93. 125-128.