штамм вируса гриппа в/60/джилин/03/1 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа В/60/Джилин/03/1 ГИСК №143 (Государственный институт стандартизации и контроля имени Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей 3-14 лет.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма В/60/Джилин/03/1.

Известный вакцинный штамм вируса гриппа - В/60/Иоханнесбург/99/50 - прототип [Патент №2215786, гос. рег. 10.11.2003, Бюл. №3. Штамм вируса гриппа В/60/Иоханнесбург/99/50 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей] утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичного вирусу В/Джилин/20/03.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Джилин/20/03.

Вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Джилин/20/03 с холодоадаптированным штаммом В/СССР/60/69 - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу В/СССР/60/69. Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа В/СССР/60/69, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. - 1994 - 151 с.].

Вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 37°С составляет 7,0 lg ЭИД ₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 25°С равна 3,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл).

Определение состава генома вакцинного штамма проводили методом сравнительного анализа электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов РНК родительских вирусов и реассортантного клона в 2,8%-ном полиакриламидном геле (Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. - 1982 - 446 с.) в присутствии 4,5 М мочевины. Вертикальный электрофорез проводили в течение 20 часов при +4°С при постоянном напряжения 100 V. Установлено, что вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации и два гена, кодирующих поверхностные белки НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу), от эпидемического вируса В/Джилин/20/03. Принадлежность гена, кодирующего поверхностный белок НА, эпидемически актуальному вирусу В/Джилин/20/03 была также подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 1% взвесью эритроцитов кур.

Результаты анализа состава генома вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 представлены в табл.1 и на чертеже, где в качестве примера схематически представлен электрофорез одноцепочечных РНК в 2,8%-ном полиакриламидном геле в присутствии 4,5 М мочевины. 1-я дорожка - эпидемический вирус гриппа В/Джилин/20/03; 2-я дорожка - реассортантный вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1; 3-я дорожка - донор аттенуации В/СССР/60/69.

Таблица 1.
Состав генома реассортантного вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Джилин/03/1 (по данным электрофореза одноцепочечных РНК в полиакриламидном геле)
Ген	Родительские вирусы								Реассортантный вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1
	Эпидемический вирус В/Джилин/20/03				Донор аттенуации В/СССР/60/69
РВ2	Дж 1				В602				В60
РВ1	Дж				В60				В60
РА	Дж				В60				В60
НА	Дж				В60				Дж
NP	Дж				В60				В60
NA	Дж				В60				Дж
М	Дж				В60				В60
NS	Дж				В60				В60
1 Ген принадлежит эпидемическому вирусу гриппа В В/Джилин/20/03.
2 Ген принадлежит донору аттенуации В/СССР/60/69.
Таблица 2.
Реактогенность для взрослых людей вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 при интраназальном введении
Препарат		Число обследуемых	Показатель	Температурные реакции (в °С)						Показатель реактогенности
				Слабые ( 37,5 °С)			Средние (37,6-38,5°С)	сильные ( 38,5°C)
Вакцина		53	абс.ч.	4			0	0		0
			%	7,55			0	0
Плацебо		42	абс.ч.	3			1	1
			%	7,14			2,38	2,38
Таблица 3.
Реактогенность для детей 3-10 лет вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 при интраназальном введении
Препарат		Число обследуемых	Показатель	Температурные реакции (в °С)						Показатель реактогенности
				Слабые ( 37,5 °С)		Средние (37,6-38,5°С)		сильные ( 38,5°C)
Вакцина		62	абс.ч.	5		0		0		0
			%	8,1		0		0
Плацебо		44	абс.ч.	3		2		1
			%	6,8		4,5		2,3

Таким образом, представленный вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса В/Джилин/20/03, структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Штамм депонирован в коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича под №143.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32-33°С в течение 72 часов - 7,5 lg ЭИД₆₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Характеристики вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 представлены в прилагаемом паспорте. На основании их штамм использовали в приготовлении вакцины и проверили вакцину на волонтерах.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - В/60/Джилин/03/1

2. Серия - серия 1

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - В/Джилин/20/03

б) донор аттенуации - В/СССР/60/69

4. Количество пассажей - 6 в процессе реассортации

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции - 32°С, 72 часа;

б) гемагглютинирующая активность - 1:512;

в) инфекционная активность - 7.5 lg ЭИД₅₀ /0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам - ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой;

д) разность в показателях инфекционной активности при 32°С и 37°С - 7.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 32°С и 25°С - 3,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

ж) структура генома реассортанта:

- гены от эпидемического вируса - НА, NA

- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации - 7 июля 2004 г.

б) объем материала в ампуле - 1,0 мл;

в) количество доз в ампуле - 4;

г) инфекционная активность - 7.0 lg ЭИД₅₀ /0.2 мл;

д) гемагглютинирующая активность - 1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:2.

8. Антигенная специфичность:

а) гемагглютинина в РТГА - идентичен вирусу В/Джилин/20/03, крысиной антисывороткой к которому полностью нейтрализуется;

б) нейраминидазы - идентична вирусу В/Джилин/20/03 по данным электрофореза одноцепочечных вирионных РНК в 2,8% ПААГ в присутствии 4,5 М мочевины.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль:

дата проведения - 9 июля 2004 года,

результат - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

ШТАММ - В/60/ДЖИЛИН/03/1 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ

Пример 1. При вакцинации 53 взрослых человек интраназально реассортантным вакцинным штаммом В/60/Джилин/03/1 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД₆₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались в 7,55% случаев. Результаты обследования приведены в таблице 2.

В группе из 42 лиц, получившей плацебо, слабые реакции наблюдались у 7,14% лиц, средние температурные реакции - у 2,38% и сильные температурные реакции - у 2,38%.

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

ШТАММ В/60/ДЖИЛИН/03/1 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-10 ЛЕТ

Пример 2. Группу из 62 детей в возрасте 3-10 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом В/60/Джилин/03/1 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД ₆₀/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 44 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 3.

В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5°С также не наблюдались. Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5°С были отмечены в 8,1% случаев.

В группе детей, получивших плацебо, наблюдались сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С и средние температурные реакции в диапазоне 37,6-38,5°С в 2,3% и 4,5% случаев соответственно. Слабые температурные реакции отмечены в 6,8% случаев.

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.

Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.