штамм бактерий bacillus subtilis м1, обладающий фунгицидной и фунгистатической активностью по отношению к возбудителям болезней культурных растений

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 111 Д 24, обладающий фунгицидной и фунгистатической активностью по отношению к возбудителям болезней культурных растений.

Описание изобретения к патенту

Штамм бактерий Bacillus subtilis M1, обладающий фунгицидной и фунгистатической активностью по отношению к возбудителям болезней культурных растений.

Изобретение относится к штамму эндофитной бактерии и может быть использовано для защиты растений от поражения фитопатогенными грибами и бактериями.

Известны биологические препараты, обладающие фунгицидными свойствами для защиты растений от черной ножки, корневой, шейковой гнили, например, на основе гриба Trichoderma harzianum [1].

Недостатком известного способа является низкая эффективность для защиты растений от таких болезней, как вертициллезный вилт, фузариозное увядание и др.

Прототипом изобретения является штамм Bacillus polymyxa 9A, изолированный из корней растений картофеля, обладающий фунгицидными свойствами против возбудителей болезней, в частности вертициллезного увядания картофеля и хлопчатника [2].

Недостатком штамма является то, что он не подавляет черную корневую гниль и фузариозное увядание.

Изобретение позволяет получить новый биологический эффект - выраженную фунгицидную и фунгистатическую активность штамма бактерии рода Bacillus к возбудителям болезней растений.

Этот эффект достигается тем, что штамм Bacillus subtilis M1, изолированный из внутренних тканей растений картофеля, обладающий фунгицидной и фунгистатической активностью по отношению к возбудителям болезней культурных растений. Используют для предпосевной обработки семян и клубней растений суспензией новой живой культуры.

Штамм Bacillus subtilis M1 выделяют следующим образом. Кусочки стебля растений картофеля в фазу цветения длиной 0,5 см стерилизуют 3 минуты 80%-ным водным раствором этанола, затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой. После этого стерильным скальпелем снимают покровные ткани с кусочков стебля и помещают кусочки на картофельно-глюкозный агар (КГА) в чашки Петри, которые инкубируют при 28°С 5-7 суток. После чего отбирают колонии светло-телесного цвета с ровными краями и рассевают их отдельно в чашки Петри как указано выше. Культуры бактерии, образовавшие колонии, оценивают на антагонистическую активность так, как описано Н.С.Егоровым (Основы учения об антибиотиках, 2004).

Согласно определителю бактерий (ред. Дж.Хоутон и др., 1997), работы "Norris et al. (1981), штамм отнесен к роду Bacillus, вид Bacillus subtilis, депонирован в коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петербург - Пушкин) под регистрационным номером «ВНИИСХМ 111 Д 24».

Штамм Bacillus subtilis M1 характеризуется следующими основными культурально-морфологическими признаками и биохимическими свойствами. Грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. Образуют эндоспоры, не раздувающие клетку. Размер клеток 1,8÷1,9×0,5 мкм. В мазках 24-часовой культуры видны прямые палочковидные клетки с закругленными концами, расположенные одиночно, попарно, реже в цепочках. Споры эллипсовидные в клетке расположены центрально, размеры 0,9×0,5 мкм. При культивировании штамма на мясопептонном агаре (МПА) в течение 24 ч при 37°С образуются плоские полупрозрачные, слегка блестящие колонии с плотным центром и неровными краями. Культура продуцирует каталазу, утилизирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, галактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты; не разлагает дульцит, рамнозу, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал и желатину, не гидролизует мочевину; утилизирует цитрат, не использует пропионат. Культура не растет в анаэробных условиях, не образует включения поли- -оксимасляной кислоты на среде МПА с глюкозой; не образует индол и сероводород, не обладает лицитиназой, гиалуронидазной и коагулирующей активностью. Штамм подавляет рост и развитие фитопатогенной микрофлоры - возбудителей грибных и бактериальных болезней пшеницы, картофеля и других растений.

Периодически пересеваемая культура штамма хранится на косячках со средой Громыко, сусло-агаре, Гаузе №2, рН 6,8-7,0 при комнатной температуре 2-3 месяца. Под минеральным маслом на среде Громыко, сусло-агаре, Гаузе №2, рН 6,8-7,0 при комнатной температуре не менее 1 года. В сублимационно-высушенном состоянии до трех лет. Для выращивания используют среду Громыко, сусло-агар, МПА, Гаузе №2.

С агаризованной среды биомасса снимается физиологическим раствором. В качестве защитной среды используют сахарозожелатиновый наполнитель. Режим лиофильного высушивания от -25°С до +32°С в течение 32 ч.

После хранения под слоем вазелинового масла или после лиофилизации культура на указанных выше средах образует однотипные колонии.

Титр бактериальных клеток в изучаемом образце культуры штамма 1 млрд. клеток и спор в 1 мл среды.

Микробный штамм Bacillus subtilis M1 относится к группе не вирулентных, не токсичных, не токсигенных микроорганизмов; не обладают способностью к диссеминации, а также дисбиотическим действием. Аллергенная активность штамма не обнаружена. Штамм не раздражает слизистые оболочки глаз при местном контакте.

Bacillus subtilis M1 не имеет медико-гигиенических противопоказаний к использованию по назначению в качестве действующего начала микробного препарата для защиты сельскохозяйственных растений от вредителей и болезней.

Штамм Bacillus subtilis M1 испытывали путем предпосевной обработки семян пшеницы.

Для обработки семян из бактериальной культуры готовили рабочую суспензию, доводя титр до 1 млрд. клеток и спор в 1 мл среды. Для обработки 1 т семян зерновых культур готовили 10 л рабочей суспензии. Обработку начинали за 12-18 ч до начала сева. В емкость засыпали семена и поливали их суспензией штамма. Вслед за увлажнением семян их тщательно перелопачивали и накрывали брезентом. Контрольные семена (1 т, контроль) обрабатывали 10 л воды.

Растения пшеницы сорта Жница из семян, обработанных штаммом M1 и водой, выращивали в одинаковых условиях на опытном поле учебно-опытного хозяйства «Миловское» ФГОУ ВПО Башкирского ГАУ.

Эффективность предпосевной обработки семян пшеницы опытной серией препарата Bacillus subtilis M1 приведена в табл.1-3.

Штамм M1 повысил всхожесть семян на 20%, стимулировал рост проростков, повысил их массу, снизил пораженность проростков возбудителями гнилей (табл.1). Биологическая эффективность штамма M1 в защите проростков от гнилей составила 34% (табл.2).

Таблица 1
Влияние обработки семян биопрепаратами штамма В.subtilis M1 на рост проростков и пораженность их возбудителями гнилей
Вариант	Всхожесть семян, %	Длина проростка, см	Масса 100 проростков, г	Гниль проростков, %
Контроль	67	13,7±0,3	3,4	28
Штамм M1	88	17,2±0,7	4,5	8

Оценка урожайности и структуры урожая пшеницы выявила, что использование препарата на основе Bacillus subtilis M1 по показателю числа продуктивных стеблей ко времени уборки предпочтительнее (табл.3).

Таблица 2
Эффективность штамма M1 против корневых гнилей пшеницы в фазу полной физиологической спелости
Вариант	Распространенность, %	Степень развития болезни, %	Биологическая эффективность, %
Контроль	70	29	0
Штамм M1	62	19	34

Применение штамма M1 было эффективным в защите растений от корневых гнилей. Прибавка урожая в сравнении с контролем составила 0,4 т/га.

Таблица 3
Влияние обработки семян штаммом Bacillus subtilis M1 на урожайность зерна пшеницы и его структуру
Вариант	Количество продуктивных стеблей, шт./м 2	Масса зерна 1 колоса, г	Масса 1000 зерен, г	Урожай зерна, т/га
Контроль	410	0,588	29,1	2,29
Штамм M1	430	0,665	33,6	2,70

Данные опытов свидетельствуют о высокой эффективности штамма M1 для предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур.

Источники информации

1. Сейкетов Г.Ш. Грибы рода триходерма и их использование на практике. - Алма-Ата: Наука, 1982. - 242 с.

2. Kado C.I., Schnathorst William C., Azad; Hamid R. Method of using Bacillus polymyxa 9A to protect plants against verticillium wilt // United States Patent №4663162. May 5, 1987 (прототип).