способ получения толерантных к ионам кадмия однодольных растений in vitro

Формула изобретения

Способ получения толерантных к ионам кадмия однодольных растении in vitro, включающий культивирование каллуса, регенерацию и укоренение на среде Мурасиге-Скуга, отличающийся тем, что культивирование каллуса проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия 5-10 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 10-30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20-30 мг/л.

Описание изобретения к патенту

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений.

Уровень техники

Известен способ выделения клеточной линии дурмана, устойчивой к хлориду кадмия, устойчивость к кадмию сохранилась у клеток дурмана после 400 генераций в неселективных условиях (Jackson P.J., Roth E.J., McClure P.R., Naranjo C.M. Selection, isolation and characterization of cadmium-resistant Datura innoria suspension culture // Plant Phys., 1984, v.75, P.914-918).

Еще в одном способе был выделен табак, растущий при содержании в среде 100 мМ CdSO₄ (Domozlicka E., Opatrny Z. The effect of cadmium on tobacco cell culture and the sebction of potentially Cd-resistant cell lines. // Biol. Plant., 1989, v.31, N 1, P.19-27).

В следующем способе отселектированная линия Lycopersicon peruvianum росла при концентрациях CdSO₄ 1,5 мМ, устойчивость к кадмию сохранялась после 30 генераций в неселективных условиях (Benetzen J.L., Adams T.L. Selection and characterization of cadmium-resistant suspension cultures of the wild tomato Lycopersicon peruvianum // Plant Cell,1984, rep.3, P.258-264).

Из суспензии клеток культурного томата удалось выделить линию, выдерживающую 5 мМ кадмия (Huang В., Hatch E., Goldsbrough P.B. Selection abd characterization of cadmium tolerant cells in tomato // Plant Physiol, 1987, v.52, P.211-221).

Во всех перечисленных выше способах получить растения из линий, устойчивых к высоким концентрациям кадмия, не удавалось. Вероятно, это было связано с очень длительным культивированием (30-400 генераций).

Самым близким по технической сущности является способ получения устойчивых к кадмию растений льна-долгунца, состоящий из культивирования каллуса на среде Мурасиге-Скуга в течение 14 пассажей, в течение 4 пассажей на среде с кадмием -15 мг/л, затем на среде без кадмия, а с 10 пассажа вновь на среде с кадмием при концентрации - 15 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 15 мг/ л и укоренение на среде Мурасиге-Скуга при концентрации кадмия 15 мг/ л кадмия (Гончарук Е.А. Влияние кадмия на морфогенез, анатомию стебля и процесс регенерации льна-долгунца из клеточных и тканевых культур in vitro, автореферат диссертации на соискании ученой степени к.б.н. // ТСХА, 2000, 23 стр.).

Недостатком данного метода являлось длительное культивирование (в течение 14 пассажей) и использование прямой селекции, которая уменьшала регенерационную способность клеток и составляла 10-13% в зависимости от сорта. Данный метод не подходит для городских растений, т.к. в городе часто фиксируются более высокие концентрации кадмия - 20 и 30 мг/л.

Задачей нашего метода было исключить вышеизложенные недостатки других методов, увеличить процент регенерации и получить устойчивые к кадмию однодольные растения.

Раскрытие изобретения

Эта задача решается созданием нового способа толерантных к ионам кадмия однодольных растений in vitro, состоящего из культивирования, регенерации и укоренения на среде Мурасиге-Скуга, причем культивирование каллуса проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия 5-10 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрацию кадмия 10-30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20-30 мг/ л кадмия.

Сущность изобретения

По мнению авторов сущность нашего метода заключается в коротком периоде культивирования и использовании ступенчатой селекции, что позволяет сохранить регенерационную способность клеток.

В данном методе была использована ступенчатая селекция, которая начиналась с адаптивных концентраций стрессового фактора (5-10 мг/л), и лишь после обогащения популяции резистентными клетками условия селекции ужесточали.

Устойчивость растений к тяжелым металлам обеспечивается молекулярными и физиологическими механизмами. Описан ряд соединений, для которых предполагают участие в детоксикации ионов тяжелых металлов. Возможно, существенную роль в формировании устойчивости к кадмию играют фитохелатины, которые образуют с ионами тяжелых металлов тиолатные комплексы.

Заявленные пределы определены следующим образом: при концентрации кадмия на стадии культивирования - более 10 мг/л более половины каллусов погибает и прирост составляет только - 28%, концентрация кадмия на стадии культивирования - менее 5 мг/л не является эффективной. При концентрации кадмия на стадии регенерации - более 30 мг/л крайне незначительная регенерационная способность (8%) и укоренение (18%). При концентрации кадмия - 60 мг/л наблюдается полная потеря регенерационной способности клеток. Использование концентраций кадмия менее 10 мг/л на стадии регенерации, менее 20 мг/л на стадии укоренения нецелесообразно для городских растений, так как в мегаполисах фиксируются более высокие концентрации кадмия. Кроме того, содержащиеся в почвах другие тяжелые металлы могут увеличивать токсичность кадмия. Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) и овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 2 пассажей, при увеличении количества пассажей наблюдается гибель большинства каллусных клеток. После культивирования в течение 2 пассажей регенерационная способность составляла - 40,5%, при культивировании в течение 3 пассажей эффективность метода снижалась, т.к. регенерационная способность составляла только - 30,0%.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты по примерам представлены в таблице.

Пример 1.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия - 5 мг/л. Продолжительность пассажа составляла 1 месяц. При культивировании каллуса сильно проявлялась гетерогенность культивируемых тканей. Интенсивность роста отдельных инокулюмов различалась в полтора-два раза. Часть каллусов погибала при культивировании, а некоторые сохраняли рост на уровне контроля.

Регенерацию проводят при концентрации кадмия 10 мг/л. Укоренение проводят при концентрации 20 мг/ л, укоренить удалось только половину растений.

Пример 2.

Культивирование каллуса овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия - 5 мг/л. Продолжительность пассажа составляла 1 месяц. При культивировании каллуса, также как у полевицы, сильно проявлялась гетерогенность культивируемых тканей.

Регенерацию проводят при концентрации кадмия 20 мг/л. Укоренение проводят при концентрации 20 мг/л, укоренить удалось только половину растений.

Пример 3.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 5 мг/ л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 20 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 4.

Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 5 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 5.

Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 7 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 10 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20 мг/л кадмия.

Пример 6.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 7 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 20 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 25 мг/л кадмия.

Пример 7.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 7 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 20 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 8.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 7 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 9.

Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 10 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 10 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20 мг/л кадмия.

Пример 10.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводили при концентрации кадмия - 10 мг/л, затем проводили регенерацию, увеличивая концентрацию кадмия до 20 мг/ л и укоренение на среде Мурасиге-Скуга при концентрации кадмия 25 мг/ л кадмия.

Пример 11.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводили при концентрации кадмия - 10 мг/л, затем проводили регенерацию, увеличивая концентрацию кадмия до 20 мг/л и укоренение на среде Мурасиге-Скуга при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 12.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводили при концентрации кадмия - 10 мг/л, затем проводили регенерацию, увеличивая концентрацию кадмия до 30 мг/л и укоренение на среде Мурасиге-Скуга при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Таблица
Влияние кадмия на рост и регенерационную способность каллуса и укоренение растений
№ примера	Концентрация кадмия на стадиях культивирования/регенерации/укоренения, мг/л	Процент прироста каллуса по отношению к контролю	% регенерации каллуса	% укоренения
1	5/10/20	70,3±2,6	40,5±2,1	50±5,3
2	5/20/25	70,3±2,6	18,0±2,0	40,0±2,0
3	5/20/30	70,3±2,6	18,0±2,0	33,3±2,8
4	5/30/30	70,3±2,6	10,5±0,8	33,3±3,0
5	7/10/20	56,2±3,3	43,5±2,1	50,0±4,5
6	7/20/25	56,2±3,3	20,5±2,8	50,0±5,0
7	7/20/30	56,2±3,3	20,5±2,1	45,3±2,5
8	7/30/30	56,2±3,3	16,0±1,8	60,0±1,8
9	10/10/20	50,2±3,0	43,3±4,0	36,0±1,8
10	10/20/25	50,2±3,0	26,0±2,6	60,5±6,8
11	10/20/30	50,2±3,0	26,0±2,6	60,5±5,1
12	10/30/30	50,2±3,0	18,0±2,8	56,0±1,8

Обсуждение результатов

Техническим результатом изобретения является прирост каллусной ткани, составляющий от 50,2% до 70,3%; регенерационная способность от 10,5% до 43,5%;укоренение 33,5-60,5%. Результаты изобретения показывают высокую эффективность данного метода, который позволил получить не только устойчивые клетки, но и высокий процент регенерации растений.

Всего в селективных условиях было получено 50 регенерантов полевицы. Большинство регенерантов полевицы имели нормальную морфологию и хороший рост и не отличались от обычных растений.

Для проверки устойчивости к высоким концентрациям кадмия регенеранты полевицы были высажены в почву со 50 и 100 мг/кг кадмия. 90% растений, полученных из кадмийустойчивых клеточных линий, росли при концентрации 50 мг/кг соли так же, как растения в почве без токсиканта.

Из 10 растений, растущих при концентрации соли кадмия 100 мг/ кг почвы, 8 имели рост и декоративные качества на уровне контроля, одно растение значительно отставало в росте и наблюдались обильные пожелтения, одно - погибло. Т.о. 80% росли при концентрации соли кадмия 100 мг/ кг почвы, также как и контрольные.

Таким образом, заявленный способ позволяет получить однодольные растения, устойчивые к высоким концентрациям кадмия.

Кроме того, неожиданным образом было получено, что 80% растений, полученных после селекции с кадмием, росли при концентрации нитрата свинца (0,4%) также хорошо, как и контрольные растения, растущие без токсиканта. При данной концентрации обычные растения не всходят, а у целых растений наблюдается очень значительное замедление роста (40% от контроля), некоторые растения погибают (20%).

Т.о. большинство растений-регенерантов, полученных из устойчивых к кадмию клеточных линий, обладало повышенной толерантностью к кадмию и свинцу. Следовательно, данный метод можно рекомендовать для получения однодольных растений, устойчивых к кадмию и свинцу.