способ прогнозирования развития сирингомиелии

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития сирингомиелии, характеризующийся тем, что проводят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование полиморфизма A/MspI сцепленного с геном альфа I цепи коллагена I типа (Col1A1) и B/MspI полиморфизма в гене альфа II цепи коллагена I типа (Соl1А2), при выявлении генотипа A/MspI*A/*A и/или B/MspI* N/*N прогнозируют риск развития сирингомиелии у обследуемого.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для прогнозирования развития сирингомиелии.

Сирингомиелия - хроническое прогрессирующее заболевание нервной системы, характеризующееся разрастанием глии (спинальный глиоз, глиоматоз) и образованием полости в спинном мозге. Основными клиническими признаками сирингомиелии являются развитие диссоциированных расстройств чувствительности, периферических парезов, преимущественно в руках, и трофических изменений кожи, костей и суставов. Врожденная форма заболевания часто имеет семейный характер и поражает чаще мужчин в возрасте 25-40 лет. Данное заболевание является краевой патологией в Башкортостане с неравномерной частотой распространения по районам и представляет собой серьезную медико-социальную проблему, так как приводит к ранней инвалидизации молодого трудоспособного населения.

Самым эффективным и экономичным направлением в медицине является профилактика заболевания. Первичная профилактика предполагает формирование групп риска сирингомиелии с использованием молекулярно-генетических маркеров заболевания и меры предупреждения развития болезни.

Применение разработанного способа обеспечивает выявление лиц с повышенным риском развития сирингомиелии с целью формирования групп высокого риска и осуществления своевременных целенаправленных мероприятий по профилактике развития данной патологии.

Известен способ прогнозирования течения нервно-психических заболеваний и степени риска их развития, заключающийся в заборе крови, получении сыворотки, иммуноферментном анализе с использованием тест-системы ELI-N-1, определении в динамике уровня сывороточных антител к антигенам нервной ткани (ATI), уровня соответствующих антиидиотипических антител (АТ2), коэффициента I, представляющего собой отношение АТ2/АТ1.

Прогнозирование осуществляют по степени выраженности отклонений исследуемых параметров от уровня нормальных значений (патент РФ 2002108749, 2003 г.). Недостатком представленного способа является его низкая прогностическая значимость вследствие недифференцированного подхода. Данный способ не позволяет оценить риск развития сирингомиелии в частности, а определяет только общий риск развития нервно-психических заболеваний, к которым относятся как моногенные расстройства с установленным этиопатогенезом (атрофическую миотонию, болезнь Гентингтона, Х-сцепленную бульбоспинальную амиотрофию, синдром Ретта и др.), так и обширная группа генетически и клинически гетерогенных состояний (Болезнь Альцгеймера, эпилепсия, шизофрения и др.), где оценить вклад наследственных и внешнесредовых факторов не представляется возможным. Кроме того, иммуноферментный анализ - достаточно дорогостоящий и сложный метод, который не столь чувствителен как полимеразная цепная реакция синтеза (ПЦР) ДНК и допускает как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.

Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ прогнозирования риска развития сирингомиелии.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования риска развития сирингомиелии, позволяющего в количественном отношении оценить риск возникновения данного заболевания.

Технический результат при использовании изобретения - получение критериев прогнозирования развития сирингомиелии.

Указанный технический результат достигается тем, что выделяют ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции, проводят генотипирование полиморфизма A/MspI сцепленного с геном альфа I цепи коллагена I типа (Col1A1) и B/MspI полиморфизма в гене альфа II цепи коллагена I типа (Соl1А2), и при выявлении генотипа A/MspI*A/*A и/или B/MspI*N/*N прогнозируют риск развития сирингомиелии у обследуемого.

Способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press. - 1984. - V.2. - P.31-34). Кровь набирают в пробирку с консервантом, содержащим 0,48% лимонной кислоты, 1,32% лимоннокислого натрия, 1,47% глюкозы, в соотношении 6:1, тщательно перемешивают и хранят при температуре 4°С не более одной недели. Для выделения ДНК к 8 мл крови добавляют 32 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl ₂, 10 мМ трис-HCl, рН 7,6. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 400 мкл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl, ресуспензируют, прибавляют 40 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл), затем образец инкубируют в термостате при 37°С в течение 18 часов. После этого из лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждается из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в деионизированной, бидистиллированной воде и хранят при -20°С. Выделенная ДНК используется для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК-локусов Col1A1A и Col1A2D выполняется в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH ₄)2SO₄, 2,5 мМ MgCl ₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера (табл.1), по 0,2 мМ dATP/dGTP/dCTP/dTTP и 1 единицу ДНК-полимеразы. Температурные режимы ПЦР представлены в таблице 2.

Амплификат, наработанный при ПНР полиморфного локуса Col1A1A и Col1A2D, подвергают ферментативному гидролизу с использованием рестриктазы MsPI «Fermentas» (к 20 мкл амплификата добавляют 5 Ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 4 часов).

Для анализа полиморфного локуса Col1А1А после проведения ПЦР отбирают 10 мкл амплификата и гидролизируют при температуре 37°С в течение 4 часов рестриктазой EcoI («Fermentas»).

Продукты, образованные при амплификации и гидролизе, оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле. Результаты электрофоретического разделения изучаемых фрагментов исследованных двух ДНК-локусов представлены на фиг.1, 2.

Электрофорез проводится в 1×TBE буфере (0,089 М трис; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0). Пробы перед нанесением на гель, смешиваются в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол и 15% фикол. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромидом этидия (0,1 мкг/мл) в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете (при длине волны 312 нм) на трансиллюминаторе.

В качестве конкретного примера проведено клинико-генетическое изучение группы неродственных больных (N=141) сирингомиелией. Набор больных осуществлялся на базе Республиканской клинической больницы им. Г.Куватова, кафедре неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета.

В работе использованы образцы ДНК обследованных больных с клиническим диагнозом сирингомиелия, состоящих на учете в медико-генетическом регистре Республики Башкортостан, а также здоровых доноров, проживающих в Башкортостане.

Контрольная группа состояла из 196 человек, не имеющих клинических признаков сирингомиелии и мальформации Арнольда-Киари, а также по возрасту и полу соответствовали группе больных с сирингомиелией.

Рядом авторов предложена гипотеза генетической основы сирингомиелии, основанная на семейном сцеплении сирингомиелии с редкими заболеваниями, ко-сегрегации с известными генетическими синдромами, а также результатах исследований с использованием близнецового метода (Speer M., et al. A genetic hypotesis for Chiari I malformation with or without syringomyelia // Neurosurg Focus. - 2000. - Vol.8, №3. - Р.1-4.)

С целью выявления генетических маркеров, ассоциированных с повышенным риском развития сирингомиелии, проведен анализ полиморфных ДНК-локусов генов-кандидатов, кодирующих 1 и 2 полипептидные цепи коллагена I типа.

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма A/MspI сцепленного с геном 1 цепи коллагена I типа (Col1A1) и B/MspI полиморфизма в гене 2 цепи коллагена I типа (Соl1А2) выполнен методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Доверительные интервалы частот аллелей и генотипов рассчитывали на основе точной формулы с использованием F-распределения [Животовский Л.А., Популяционная биометрия. - M.: Наука, 1991].

При попарном сравнении частот генотипов и аллелей ДНК-локусов Col1A1A и Col1A2D в группах больных и здоровых лиц использовался критерий хи-квадрат ( ²) для таблиц сопряженности 2×2 с поправкой Иэйтса на непрерывность, вычисляемый по формуле:

где n₁ и n ₂ - объемы сравниваемых распределений; p ₁ и р₂ - частоты соответствующих классов. При числе наблюдаемых случаев менее 5 использовался точный двусторонний критерий Фишера р(F₂ ).

Для подтверждения гипотезы о влиянии какого-то аллельного варианта или генотипа как протективного феномена или фактора риска развития сирингомиелии нами проведена, для статистически значимо различающихся вариаций проанализированных вышеуказанных полиморфных ДНК-локусов, оценка статистики связи - показателя отношения шансов (OR - odds ratio), a также границ его 95% доверительного интервала (CI95%). OR является мерой ассоциации, количественно определяющей взаимосвязь между фактором риска и развитием расстройства в ретроспективном исследовании. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя OR, по формуле предложенной Бландом (Bland, J.M. The odds ratio / J.M.Bland, D.G.Altman // Br.Med.J. - 2000. - Vol.320. - P.1468):

OR=(a×d)/(b×c),

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера среди больных; c и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых доноров.

При OR=1 - нет ассоциации, OR>1 рассматривается как положительная ассоциация заболевания с аллелем или генотипом («фактор риска») и OR<1 - как отрицательная ассоциация («фактор устойчивости»).

Доверительный интервал для показателя отношения шансов рассчитывался по формуле:

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ Statistica ver. 6.0 (StatSoft, Inc., 2001), программы «R×C» (Rows × Columns).

В ходе проведенного анализа полиморфизма A/MspI, сцепленного с геном Col1A1, локализованным в области 17q21.33, выявлено, что аллель *А и гомозиготный генотип *А/*А, выступают как факторы риска развития сирингомиелии (OR=1,52 CI% 1,00-1,99; OR-1,28, CI% 1,05-1,59 соответственно).

Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма B/MspI в гене Соl1А2, показал, что аллель *N и генотип *N/*N также ассоциированы с повышенным риском развития сирингомиелии (OR=1,96, CI% 0,72-2,44; OR-1,37 CI% 1,06-1,69 соответственно).

Таким образом, в ходе проведенного исследования установлено, что выявление генотипа A/MspI*А/*А и/или B/MspI*N/*N позволяет прогнозировать риск развития сирингомиелии у обследуемого.

На фиг.1 изображено электрофоретическое разделение продуктов амплификации локуса Col1A1A. Дорожки 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17 соответствуют генотипу - Col1A1А*А1/*А1; 6, 9, 12 - генотипу Соl1А1А*А1/А2; М - маркер молекулярного веса PuC19 (MspI).

На фиг.2 изображено электрофоретическое разделение продуктов амплификации локуса Col1A1D. Дорожки 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 соответствуют генотипу Col1A1D*N1/*N1; 10 - генотипу Col1A1A*N1/N2; 4 - генотипу Col1A1A*N2/N2; М - маркер молекулярного веса 100 bp DNA Ladder #SM0328.

Пример 1.

Обследуемый Б., 1972 г.р., сын пробанда А., 1939 г.р. с установленным диагнозом сирингомиелии, смешанной формы, медленнопрогрессирующего течения с поражением сегментов спинного мозга CII-DVII, умеренным верхним парапарезом по периферическому типу, пирамидной недостаточностью в ногах, гипэстезией, трофическими нарушениями в руках. Диагноз пробанду А. установлен клинически в 1985 году, подтвержден магниторезонансной томографией в 2002 году. На момент обследования Б. клинически здоров.

Учитывая отягощенный семейный анамнез, было принято решение определить риск развития сирингомиелии у наблюдаемого Б. С этой целью у него была взята из вены кровь, выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и проведен генетический анализ полиморфизма A/MspI, сцепленного с геном 1 цепи коллагена I типа (Col1A1), и B/MspI полиморфизма в гене 2 цепи коллагена I типа (Соl1А2) методом полиморфизма длины рестрикционных фрагметов

Анализ показал, что обследуемый Б. является носителем генотипа A/MspI*А/*А. В отношении него был определен риск развития сирингомиелии, были предприняты необходимые меры профилактического характера, он был взят на диспансерный учет, даны рекомендации по наиболее подходящему образу жизни, рациональному трудоустройству.

Способ прогнозирования развития сирингомиелии

Таблица 1
Тип полиморфизма, последовательность праймеров и номенклатура аллелей анализируемых ДНК-маркеров
Ген [OMIM], локализация		Полиморфизм (аллели)		Праймеры (рестриктаза)				Источник
Col1A1		Site A		5'cagtttatcagatcctagtagttgag3'				Baker et al.
[120150]		*A1 (0.1+0.1kb)		5'caatagccaggctggttttgaactcc3'				2001
17q 21.3		*А2 0.2 kb		(MsPI)
Col1A2		Site D		5'tgtaagtttgtgaataccagt3'				Baker et al.
[120160]		*N1 (0.85+0.45 kb)		5'catcaacttcatagtccttgg3'				2001
17q 21.1		*N1 1.3kb		(MsPI)
		Константа 0.6 kb
Таблица 2
Температурные режимы амплификации ДНК-локусов
Этапы ПЦР			Col1A1A			Col1A2D
			t°C		мин', сек''	t°C	мин', сек''
1.	Начальная денатурация		94		4'	94	4'
2.	Денатурация		95		45"	93	1'
	Отжиг		57		45"	62	1'
	Элонгация		72		1'	72	1'
	Число циклов		30			30
3.	Пост-ПЦР		72		10"	72	10"