бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид, проявляющий антиоксидантную, гепатопротекторную и иммуномодулирующую активность

Формула изобретения

-Гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид формулы

проявляющий антиоксидантную, гепатопротекторную и иммуномодулирующую активность.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к синтезу новых биологически активных химических соединений, конкретно к -гидроксиникотиноилгидразону 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорида общей формулы I:

который обладает антиоксидантным, гепатопротекторным и иммуномодулирующим действием и может найти применение в медицине.

Прототипом по действию и соединением родственным по химической структуре, является широко применяемый в медицине антиоксидант - мексидол.

Задачей изобретения является создание более эффективного антиоксиданта, проявляющего дополнительно иммуномодулирующую и гепатопротекторную активность.

Поставленная задача достигается новой химической структурой формулы I, получаемой при взаимодействии гидразида 5-гидроксиникотиновой кислоты с 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридином гидрохлоридом в присутствии растворителя и соляной кислоты при нагревании. Выход целевого продукта составил 93,3% от теоретического. Соединение I - светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде, мало растворимое в ДМСО и других органических растворителях.

Т. пл. (с разложением) 216-217°С. Найдено, %: С 45,00; Н 4,26; N 14,65; Cl 18,75: C₁₄H ₁₆N₄O₄Cl ₂. Вычислено, %: С 44,80; Н 4,26; N 14,91; Cl 18,92; ИК-спектр, см^-1: 3370, 3310, 1680, 1610, 1550, 1310, 1150, 1050, 830. УФ-спектр, нм: 300,338 (в этаноле). Пример. -Гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид (I).

К раствору 3,06 г (0,02 моль) гидразида 5-гидроксиникотиновой кислоты в 450 мл воды при 35-40°С добавляют 3,3 мл соляной кислоты, раствор 4,07 г (0,02 моль) 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина гидрохлорида в 19 мл воды и перемешивают при 55-60°С в течение 1 часа. Реакционную массу упаривают в вакууме при 75-80°С и Р _ост.=20 мм рт.ст., досушивают при 100°С, получают 7,0 г соединения I (93,3%).

Острую токсичность исследуемого соединения I и препарата сравнения - мексидола изучали в опытах на мышах массой 18-22 г с определением ЛД₅₀ по методу Литчфилда и Уилкоксона. Соединения вводили внутрибрюшинно. ЛД₅₀ соединения I составляет 700 мг/кг, мексидола - 800 мг/кг.

Было изучено влияние соединения I и мексидола на антиоксидантную, гепатопротекторную и иммунологическую реактивность крыс, индуцированную эритроцитами барана (ЭБ), в норме, а также в условиях повышенной и пониженной иммунной реактивности. Проведены следующие серии экспериментов:

1 серия экспериментов - на здоровых животных;

2 серия экспериментов - в условиях острого токсического поражения печени;

3 серия экспериментов - в условиях экспериментального острого панкреатита.

Исследования проведены на крысах Вистар массой 120-180 г. В первой серии экспериментов соединение I и мексидол вводили пятикратно (интервал 24 ч), внутрибрюшинно. Развитие гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) индуцировали внутрибрюшинным введением ЭБ (однократно в дозе 10⁸ кл/кг). Для оценки выраженности ГИО в селезенке определяли количество антителообразующих клеток (АОК) (Мальберг К., Зигль Э., 1987) и число иммунных розеткообразующих клеток (РОК) (Зауэр X., 1987) через 5 суток после внутрибрюшинной иммунизации (2×10⁹ ЭБ). При оценке выраженности ГЗТ, через 4 суток после внутрибрюшинной сенсибилизации ЭБ (10 клеток), в подушечку задней конечности вводили разрешающую дозу антигена (10⁶ ЭБ). Спустя 24 ч определяли разницу массы (РМЛ) и количества кариоцитов (РКЛ) в регионарном и контралатеральном лимфатических узлах (Федосеева В.Н. и соавт., 1993).

Во второй серии экспериментов воспроизводили модель острого токсического гепатита путем внутримышечного введения 50% раствора четыреххлористого углерода (CCl₄ ) на оливковом масле (3 мл/кг) и внутрибрюшинного введения соединения I и мексидола в течение 5 дней с интервалом 24 ч. Развитие ГИО и ГЗТ индуцировали так же, как и в первой серии экспериментов.

В третьей серии экспериментов моделировали острый панкреатит по Шалимову С.А. и соавт. (1989) в модификации Чуевой Т.В.(2002). Экспериментальным крысам проводили лапаротомию, затем при помощи жидкого азота производили криогенное воздействие на головку поджелудочной железы, через 3 часа развивался острый отечный панкреатит, подтвержденный морфологически. Соединение I и мексидол вводили внутрибрюшинно в течение 7 дней после операции с интервалом 24 ч. Экспериментально установлено, что максимальная иммуносупрессия при моделировании острого панкреатита отмечается на 5-7 сутки. В связи с этим исследование количества АОК, РОК и показателей ГЗТ проводили на 7 сутки после лапаротомии по той же схеме, что и в первой серии экспериментов.

Соединение I и мексидол вводили во всех исследованиях в экспериментально подобранных дозах 35 мг/кг и 30 мг/кг соответственно. Животных выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом.

Интенсивность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию в сыворотке крови ацилгидроперекисей (В.И.Бенисевич, Л.И.Идельсон, 1973) и малонового диальдегида (Н.Д.Стальная, Т.Г.Гаришвилли, 1977). Антиоксидантный статус оценивали по методике вычисления каталазного числа. Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами. Математический анализ полученных данных проводили с помощью программы «Statistica 6.0 StatSoft, USA».

Установлено, что пятикратное внутрибрюшинное введение соединения I вызывает достоверное иммуностимулирующее действие, увеличивает количество АОК в 2,1 раза и РОК в 1,9 раза по сравнению с контролем. Внутрибрюшинное введение мексидола не оказывает влияния на иммунный ответ животных (табл.1).

Таблица 1 Острая токсичность и влияние соединения I и мексидола на формирование ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ
№ гр.	Условия опыта	ЛД50 , мг/кг	АОК, тыс./орган	РОК, млн./орган	РМЛ, мг	РКЛ, ×106
1	Иммунизация ЭБ	-	21,2±3,1*4	95,5±6,5*4	1,8±0,2 *3,4	1,3±0,1*3,4
2	Введение физиологического раствора	-	22,9±2,3*4	91,0±6,1 *4	1,7±0,2*3,4	1,2±0,1*3,4
3	Введение мексидола	800	21,9±3,2 *4	108,3±9,9*4	4,6±0,4*1,2	3,1±0,3*1,2
4	Введение соединения I	700	46,8±3,5* 1,2,3	170,4±10,1* 1,2,3	4,5±0,4* 1,2	3,3±0,3*1,2
Примечание: здесь и в последующих таблицах: * - р<0,05, цифра рядом со звездочкой указывает, по отношению к показателю какой группы различия достоверны.

Как следует из данных, приведенных в табл.1, соединение I стимулирует развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа на эритроциты барана. Разница масс регионального и контралатерального лимфатических узлов (РМЛ) и количество в них ядросодержащих клеток (РКЛ) при введении соединения I увеличиваются в 2,7 раза. Препарат сравнения - мексидол обладает аналогичной активностью.

При исследовании биохимических показателей сыворотки крови здоровых животных, характеризующих антиоксидантную активность, установлено, что введение соединения I и мексидола не влияет на данные показатели и, следовательно, на процессы ПОЛ (табл.2).

Таблица 2 Влияние соединения I и мексидола на процессы перекисного окисления липидов у крыс
№ гр.	Условия опыта	АГП, усл.ед.	МДА, мкмоль/л	Каталазное число
1	Интактные крысы	2,3±0,1	24,5±4,3	25,3±3,3
2	Введение физиологического раствора	2,2±0,1	28,4±4,6	28,3±4,0
3	Введение мексидола	2,2±0,2	27,8±5,3	20,4±3,1
4	Введение соединения I	2,1±0,1	25,1±4,2	24,6±4,0

Во второй серии экспериментов была изучена иммуномодулирующая активность соединения I и мексидола в условиях повышенной иммунной реактивности. В качестве экспериментальной модели патологии была использована модель токсического поражения печени, которая моделировалась путем внутримышечного введения четыреххлористого углерода (CCl ₄) (табл.3).

Таблица 3 Влияние соединения I и мексидола на формирование ГИО и ГЗТ в условиях острого токсического поражения печени
№ гр.	Условия опыта	АОК, тыс./орган	РОК, млн./орган	РМЛ, Мг	РКЛ, ×10 6
1	Иммунизация ЭБ	18,5±2,0*3,4	96,5±6,5*3,4	1,8±0,1*3,4	1,4±0,2*3,4
2	Введение оливкового масла	22,3±2,5*3	107,3±5,1*3,4	1,9±0,2*3,4	1,4±0,2*3,4
3	Введение CCl 4	58,4±4,6*1,2,4,5	174,3±8,8*1,2,4,5	5,5±0,2*1.2,4,5	5,4±0,2*1,2,4,5
4	Введение CCl4 и мексидола	30,4±3,1* 1,3	135,9±7,2* 1-3,5	3,0±0,2 *1-3,5	2,3±0,2 *1-3
5	Введение CCl4 и соединения I	24,1±2,3*3	110,б±7,1* 3,4	2,1±0,2*3,4	2,0±0,3*3

Установлено, что внутримышечное введение крысам в течение 5 дней оливкового масла не влияет на формирование ГИО, индуцированного ЭБ. Введение CCl₄ повышает иммунологическую реактивность на ЭБ, что проявляется увеличением в селезенке отравленных крыс числа иммунных АОК в 3,2 раза, РОК в 1,8 раза по сравнению с контрольной группой животных (табл.3).

При внутрибрюшинном введении соединения I, в течение 5 суток в дозе 35 мг/кг, показатели количества АОК и РОК оставались на уровне контрольных данных, несмотря на введение CCl₄. Иммуномодулирующая активность соединения I превосходит таковую у мексидола.

Исследование развития ГЗТ выявило аналогичную с ГИО динамику изменения показателей. Установлено, что максимальным корригирующим влиянием на показатели РМЛ и РКЛ, при токсическом поражении печени, обладает соединение I. Внутрибрюшинное введение соединения I в дозе 35 мг/кг оказывает выраженное гепатопротекторное действие, в серии экспериментов с данным соединением не наблюдалось достоверного увеличения показателей РМЛ и РКЛ по сравнению с контрольными данными (табл.3).

Введение CCl₄ статистически достоверно приводит к выраженному повышению содержания продуктов ПОЛ в экспериментальной группе животных. Кроме того, отмечается достоверное, в 2,1 раза, снижение активности каталазы, по сравнению с контрольной группой животных (табл.4). Все это дает возможность говорить об усилении процессов ПОЛ у животных в условиях острой токсической гепатопатии.

Таблица 4 Влияние соединения I и мексидола на процессы перекисного окисления липидов в условиях острого токсического поражения печени
№ гр.	Условия опыта	АГП усл. ед.	МДА мкмоль/л	Каталазное число
1.	Интактные крысы	2,3±0,1 *2,3	24,5+4,3*2,3	25,3±3,3*2,3
2.	Введение CCl4	4,7+0,2* 1,3,4	39,6+3,2*1,4	12.4+1,7*1,4
3.	Введение CCl 4 и мексидола	3,5±0,1* 1,2,4	31,6±3,2* 1,2,4	14,3±1,6* 1,4
4.	Введение CCl4 и соединения I	2,3±0,1*2,3	22,9±2,1* 2,3	23,1±2,3* 2,3

Соединение I проявляет выраженные антиоксидантные и мембранно-стабилизирующие свойства в условиях токсической гепатопатии. Его внутрибрюшинное введение полностью защищает мембраны гепатоцитов от повреждающего действия CCl ₄, показатели интенсивности ПОЛ остаются на уровне контрольных данных. Внутрибрюшинное введение мексидола уменьшает выраженность процессов ПОЛ, но уступает по активности соединению I. Так, введение мексидола в дозе 30 мг/кг, уменьшает концентрацию АГП и МДА в 1,3 раза, увеличивает концентрацию каталазы в 1,2 раза по сравнению с данными, полученными у животных с токсической гепатопатией (табл.4).

В третьей серии экспериментов изучалась коррекция нарушений иммунной реактивности соединением I и мексидолом в условиях вторичного иммунодефицита на модели острого отечного панкреатита. Результаты экспериментов по изучению ГИО и ГЗТ на ЭБ при экспериментальном остром отечном панкреатите представлены в табл.5. Выявлено, что на 7-е сутки количество иммунных АОК и РОК в селезенке крыс с острым панкреатитом уменьшилось по сравнению с контролем в 2,6 и 2,3 раза соответственно. Показатели РМЛ и РКЛ уменьшились в 1,7 и 1,9 раза соответственно. Данные показатели в группе животных с ложной лапаротомией не отличаются от контрольных данных.

Таблица 5 Влияние соединения I и мексидола на формирование ГИО и ГЗТ в условиях острого отечного панкреатита
№ гр.	Условия опыта	АОК, тыс./орган	РОК, млн./орган	РМЛ, мг	РКЛ, ×l0 6
1	Иммунизация ЭБ	18,5±2,0*3,4	96,5±6,5*3,4	1,8±0,1*3	1,4±0,2*3
2	Ложная лапаротомия	16,5±1,9*3	94,7±5,9*3,4	1,6±0,2*3	1,5±0,2 *3
3	Острый панкреатит	7,2±1,1* 1,2,4,5	42,3±4,6* 1,2,4,5	1,0±0,1 *1,2,4,5	0,8±0,2 *1,2,3,4
4	Острый панкреатит и введение мексидола	11,8±1,3* 1,3	72,5±7,1* 1,2,3	1,3±0,1 *3	1,4±0,2*3
5	Острый панкреатит и введение соединения I	16,3±2,1* 3	81,4±7,2*3	1,7±0,2*3	1,4±0,2*3

Введение препарата сравнения - мексидола достоверно увеличивает количество антитело - и розеткообразующих клеток. Однако данные показатели не достигают уровня контрольных значений. Введение соединения I, как и в серии экспериментов с моделированием токсического поражения печени, оказывает максимальное воздействие на иммунную реактивность крыс, индуцированную ЭБ, в условиях острого панкреатита. Показатели АОК и РОК в данной серии экспериментов остаются на уровне контрольных данных, т.е. наблюдается иммунокоррегирующий эффект, наиболее выраженный в условиях вторичного иммунодефицита.

Соединение I стимулирует развитие реакции ГЗТ в условиях острого панкреатита. Показатели РМЛ и РКЛ в серии экспериментов с введением данного соединения достигают уровня контрольных значений. Данная тенденция наблюдается и в сериях экспериментов с введением мексидола. Однако показатель РМЛ в экспериментах с применением мексидола не достигает уровня контрольных значений (табл.5).

Экспериментальная модель острого отечного панкреатита характеризуется развитием цитолитического поражения тканей и увеличением концентрации продуктов ПОЛ. Концентрация АГП и МДА возрастает в 3,2 и 2 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой животных. Активность каталазы снижается с 25,3±3,9 в контроле, до 8,4±1,1 в группе животных с острым панкреатитом (табл.6).

Таблица 6 Влияние соединения I и мексидола на процессы перекисного окисления липидов в условиях острого отечного панкреатита.
№ гр.	Условия опыта	АГП усл.ед	МДА мкмоль/л	Каталазное Число
1.	Интактные крысы	2,3±0,1 *3-5	24,5+4,3*3	25,3+3,3*3,4
2.	Ложная лапаротомия	2,2±0,1*3-5	27,1±2,4*3	23,5±2,1 *3,4
3.	Острый панкреатит	7,4±0,3* 1,2,4,5	49,1±4,1* 1.2,4,5	8,3±1,1* 1,2,4,5
4.	Острый панкреатит и введение мексидола	4,8±0,3* 1-3,5	32,0±4,3* 3	14,6±1,9*1-3,5
5.	Острый панкреатит и введение соединения I	3,9±0,3* 1-4	25,4±1,3* 3,5-7	20,1±2,0* 3,4

Следует отметить, что в группе «ложнооперированных» животных не наблюдается отклонения показателей уровня продуктов ПОЛ и активности каталазы от контрольных данных. Введение соединения I в условиях острого отечного панкреатита сохраняет исследуемые показатели на уровне контрольных данных. По антиоксидантному и мембранопротекторному действию данное соединение превосходит мексидол (табл.6).

Таким образом, заявляемое соединение I в дозе 35 мг/кг вызывает выраженную стимуляцию гуморального иммунного ответа у крыс. Мексидол в дозе 30 мг/кг данной активностью не обладает.

Соединение I и мексидол не влияют на процессы перекисного окисления липидов в физиологических условиях.

По влиянию на реакцию гиперчувствительности замедленного типа соединение I проявляет равную с мексидолом активность.

Соединение I отменяет иммуносупрессирующий эффект, возникающий при экспериментальном остром панкреатите, и иммуностимуляцию, индуцированную введением CCl₄, и на данных моделях превосходит по иммуномодулирующему, антиоксидантному и гепатопротекторному действию препарат сравнения - мексидол.

Данное соединение может быть использовано при создании препаратов с антиоксидантным, иммуномодулирующим и гепатопротекторным действием.