способ разделения фибрина на фракции

Формула изобретения

Способ разделения фибрина на фракции путем растворения его в солевом растворе с последующей инкубацией при температуре 37-38°С в течение 18-24 ч и разделением с помощью делительной воронки, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют 18-22,5%-ный раствор поваренной соли.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к гематологии, и касается поиска новых направлений в изучении составных частей крови, в частности фибрина сгустка крови.

Известным способом получения фракции фибрина, выделенного из сгустка крови, является его растворение в 0,5-2,0% растворе гидрата окиси натрия с последующей инкубацией при температуре 37-38°С, при этом образуются три фракции с помощью делительной воронки (1).

Однако этот способ имеет два недостатка.

1. Для растворения и разделения фибрина используют 0,5-2,0% раствор гидрата окиси натрия, сильного основания, который даже в небольшой концентрации может приводить к гидролизу белка.

2. После получения фракций фибрина из делительной воронки для дальнейшего исследования едкий натрий необходимо нейтрализовать путем добавления индикатора и кислоты, которые могут мешать при дальнейшем исследовании или использовании фракций фибрина.

Цель изобретения - получить фракции фибрина без применения едкого натрия с использованием нейтральной соли с последующим добавлением дистиллированной воды до получения фракций фибрина в физиологическом растворе (0,9%) хлористого натрия.

Цель достигается следующим образом.

Из сгустка крови выделяют фибрин по разработанному способу (2). После отмывания фибрина от остатков гемоглобина его помещают в делительную воронку в 18-22,5% раствор хлористого натрия из расчета 1 г сырого фибрина на 5-10 мл раствора. После этого делительную воронку помещают в термостат при температуре 37-38°С на 18-24 часа. Не встряхивают. Через 18-24 часа весь фибрин делится на 5-8 фракций (см. чертеж). Все фракции имеют четкую горизонтальную границу, разделяющую их друг от друга, и один красноватый цвет, интенсивность которого убывает снизу вверх.

После сливания фракций из делительной воронки получают физиологический раствор фибрина в 0,9% хлористом натрии путем добавления дистиллированной воды (при 18% растворе соли добавляют на 1 мл 17 мл воды, а при 22,5% растворе на 1 мл добавляют 21,5 мл воды).

Характеристика конечного продукта

Для разделения фибрина в солевом растворе выбрана концентрация соли от 18 до 22,5% потому, что при меньшей концентрации и инкубации при температуре 37°С в течение 18-24 часов возможен рост микробов и гниение белка. При выбранной концентрации этого не происходит.

Разделение фибрина с горизонтальными линиями раздела, которые остаются горизонтальными при наклонении делительной воронки вправо или влево, определяется следующими возможными причинами.

1. В процессе свертывания участвует много белковых веществ крови, имеющих различный молекулярный вес.

2. Все белковые вещества, участвующие в свертывании крови, связаны между собой не прочными химическими связями, а как бы адсорбируются друг на друга и быстро разделяются и занимают положение в пробирке в зависимости от своего молекулярного веса

3. Любая смесь животных белков, имеющих различный молекулярный вес в солевых растворах, при центрифугировании делится именно таким образом с четкими горизонтальными границами при убывании плотности раствора снизу вверх.

Все фракции фибрина имеют красноватый опалесцирующий цвет, убывающий по интенсивности снизу вверх. Количество белка в каждой фракции также убывает снизу вверх на 5-10% и в таком же порядке убывает снизу вверх количество плотных веществ. Кроме вышеперечисленных показателей, в каждой фракции исследовался удельный вес, относительная вязкость и альбумины. Все они с разных сторон характеризуют именно белковые растворы. Все эти показатели также убывают снизу вверх (вязкость по 0,02-0,05 ед; удельный вес по 0,02-0,03 ед; альбумины по 3-8%). Таким образом, все фракции содержат белок, количество которого убывает снизу вверх.

Использование предлагаемого способа.

Для использования предложенного способа разделения фибрина на фракции было избрано 2 варианта - разделение фибрина от одного донора и разделение фибрина, полученного из сгустков крови нескольких доноров.

По первому варианту кровь была взята у донора-мужчины 34 лет в количестве 400,0 мл в один флакон. После образования сгустка сыворотка была удалена и использована для изготовления препаратов для определения групповой принадлежности крови, а из оставшегося сгустка был выделен фибрин в количестве 5,5 г. Полученный сырой фибрин был помещен в 55 мл 18%-ного раствора хлористого натрия в 100 мл-ой делительной воронке. Инкубация при температуре 37,5°С продолжалась 20 часов. После инкубации фибрин был осмотрен и в нем определялось 6 фракций, имеющих четкие горизонтальные ограничительные линии. По качественным показателям по выбранным критериям все фракции укладывались в представленные выше цифровые закономерности.

По второму варианту кровь была взята (также для выработки сывороточных препаратов) в 400,0 мл флакон у 5 доноров (3-х мужчин в возрасте 28-45 лет и 2 женщин в возрасте 21-38 лет). Из оставшихся сгустков этих доноров было выделено 23,5 г сырого фибрина. Он был помещен в 220 мл 22,5%-ного раствора поваренной соли в 250 мл-ой делительной воронке. Инкубация при температуре 37,5°С продолжалась 22 часа. После инкубации в воронке определялось 7 фракций фибрина. Увеличение количества фракций возможно связано с увеличением количества фибрина, взятого для исследования, а также с большим числом доноров (смесь фибрина), имеющих разный возраст, пол, а следовательно, и разный белок, входящий в состав фибрина. По своим качествам, выбранным для характеристики фибрина, он полностью соответствовал представленным выше цифровым величинам.

Литература

1. Патент №2056848. Способ получения фракций фибрина. Фигурнов В.А.

2. Патент №1573571. Способ получения фибрина из сгустка крови. Фигурнов В.А., Фигурнов А.В.