способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи

Формула изобретения

Способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи, предусматривающий проведение амплификации (ПЦР-анализа) фрагмента гена прионового протеина овец, включающего три основных информативных кодона - 126, 154, 171, отличающийся тем, что после проведения ПЦР-анализа подготовленные ампликоны гибридизируют с секвенирующими праймерами и диагностируют нуклеотидную последовательность гена в трех наиболее информативных кодонах (136, 154 и 171) в режиме реального времени с одновременным определением семи аминокислот (A, R, Q, Y, V, Т и К) с применением технологии пиросеквенирования и установлением генотипа, тип которого позволяет сделать заключение об устойчивости овец к скрепи на основании предварительно установленных классов генетической устойчивости G1-G5.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетики, в частности к способам генодиагностики устойчивости овец к скрепи.

Известен способ диагностики скрепи, основанный на гистологическом исследовании головного мозга животных, имевших при жизни симптомы поражения центральной нервной системы и убитых в терминальной стадии болезни (Методические указания по патогистологической диагностике прионных инфекций животных, - Минсельхозпрод России, Деп. Ветеринарии. - 06.05.1997. - N. 13-17-2/939). Недостатком данного способа диагностики является патогистологический характер исследований, основанный на несовместимой с жизнью диагностике прионной инфекции.

Известен способ диагностики скрепи с использованием иммуноблотинга и иммуногистохимии на скрепи-ассоциированные фибриллы (SAF) (vanKeulen, L.J.M., Schreuder В.Е.С., Meloen R.H., Mooij-Harkes G., Vromans M.Е.W., J.Р.M. Langeveld. Immunohistochemical detection of prion protein in lymphoid tissues of sheep with natural scrapie // J. Clin. Microbiol. - 1996. - V.34. - P.1228-1231; Buschmann A., Luhken G., Schultz J., Erhardt G., Groschup M.H. Neuronal accumulation of abnormal prion protein in sheep carrying a scrapie-resistant genotype (PrP^ARR/ARR ) // Gen. Virol. - 2004. - V.85. - P.2727-2733). Способ позволяет проводить прижизненную диагностику патогенного приона, персистирующего в организме животного или находящегося в клеточных культурах. Данный способ констатирует факт наличия/ отсутствия самого прионового белка, его тканевую локализацию и определяет уровень его экспрессии.

Известен способ диагностики устойчивости овец и коз к скрепи по анализу аминокислотных последовательностей гена прионового белка - нормального компонента клеток млекопитающих. Ген прионового протеина (PrP) расположен на 13 хромосоме овец, имеет белоккодирующую область в 3 экзоне, состоящую из 768 нуклеотидов, что соответствует 256 аминокислотам (Basler К., Oesch В., Scott M., Westaway D., Walchli M., Groth D.F., McKinley M.P., Prusiner S.В., and Weismann C. Scrapie and cellular PrP isoforms are encoded by the same chromosomal gene // Cell. - 1986. - V.46. - P.417-428; Westaway D., Zuliani V., Cooper C.M., Dacosta M., Neuman S., Jenny A.L., Detwiler L., Prusiner S.B. Homozygosity for prion protein alleles encoding glutamine-171 renders sheep susceptible to natural scrapie // Genes and development. - 1994. - V.8 (8). - P.959-969; Lee I.Y., Westaway D., Smit A.F.A., Wang K., Seto J., Chen L., Acharya C., Ankener M., Baskin D., Cooper C., Yao H., Prusiner S.В., Hood L.E. Complete genomic sequence and analysis of the prion protein gene region from three mammalian species // Genome Res. - 1998. - V.8. - I.10. - P.1022-1037). Данный способ диагностики основан на выявлении мутаций в различных кодонах и их ассоциации с устойчивостью или, наоборот, чувствительностью к развитию скрепи в лабораторных условиях (Goldmann W., Hunter N., Foster J.D., Salbaum J.M., Beyreuther K., Hope J. Two alleles of a neural protein gene linked to scrapie in sheep // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1990. - V.87. - №7. - Р.2476-2480; Goldmann W., Hunter N., Benson G., Foster J.D., Hope J. Different scrapie-associated fibril proteins (Prp) are encoded by lines of sheep selected for different alleles of the Sip gene // J.Gen. Virol. - 1991. - V.72. - №10. - Р.2411-2417; Goldmann W., Hunter N., Smith G., Foster J., Hope J. Prp genotype and agent effects in scrapie-change in allelic interaction with different isolates of agent in sheep, a natural host of scrapie. // Journal of General Virology. - 1994. - V.75. - №5. - P.989-995).

Известен способ диагностики генетической устойчивости овец к скрепи на основе полиморфизма гена прионового протеина с использованием денатурирующего градиентного гель электрофореза (DGGE) (Laplanche J.L., Chatelain J., Westaway D., Thomas S., Dussaucy M., Brugere-Picoux J., Launay J.M. PrP polymorphisms associated with natural scrapie discovered by denaturing gradient gel electrophoresis // Genomics. - 1993. - №1. - P.30-37). К недостаткам этого метода относится использование дорогостоящего оборудования и токсичных для здоровья человека реактивов.

Известен способ диагностики генетической устойчивости овец к скрепи на основе стандартного метода полимеразной цепной реакции с последующим определением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) анализа (Yuzbasian-Gurkan V., Blanton S.H., Cao Y., Ferguson P., Li J., Venta P.J., Brewer G.J. Linkage of a Microsatellite Marker to the Canine Copper Toxicosis locus in Bedlington Terriers // Am J. Vet. Res. - 1997. - V.58 (1). - P.23-27. Lockley A.K., Hosie В. D., Moore L., Harling R., Bardsley R.G. PCR-based detection of the polymorphism at codon 136 in the ovine prion protein gene // Anim. Biotechnol. - 2000. - V.11 (1). - P.69-73. Lühken G., Buschmann A., Groschup M.H., Erhardt G. Prion protein allele A136H154Q171 is associated with high susceptibility to scrapie in purebred and crossbred German Merinoland sheep // Arch. Virol. - 2004. - V.149. - P.1571-1580). Данный способ наиболее широко распространен во многих лабораториях, но его специфичность зависит от активности используемых ферментов, квалификации исследователя и требует больших временных затрат.

Известен способ генодиагностики полиморфизма гена прионового протеина с использованием аллель-специфической гибридизации к иммобилизованным ПЦР продуктам (Hunter N., Moore L., Hosie B.D., Dingwall W.S., Greig A. Searching for BSE in sheep: interpreting the results so far // Veterinary Record. - 1997. - V.141. - P.137-140).

Известен способ генодиагностики полиморфизма гена прионового протеина с использованием метода дот блот гибридизации с ³²Р мечеными пробами (Ishiguro N., Shinagawa М., Onoe S., Yamanouchi К., Saito Т. Rapid analysis of allelic variants of the sheep PrP gene by oligonucleotide probes // Microbiol Immunol. - 1998. - V.42 (8). - P.579-582). К недостаткам данного способа можно отнести радиоактивное мечение проб.

Известен способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи на основе анализа секвенированных последовательностей гена прионового белка (Junghans F., Teufel В., Buschmann A., Steng G., Groschup M.H. Genotyping of German sheep with respect to scrapie susceptibility // Vet. Rec. - 1998. - V.143. - №12. - Р.340-341). Данный способ наряду с высокой точностью является очень трудоемким и дорогостоящим. Точный результат секвенирования возможен лишь при наличии высокомолекулярной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты - носителя наследственной информации), современного оборудования и высококвалифицированного персонала.

Известен способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи, взятый в качестве прототипа, основанный на анализе выделенной ДНК методом ПНР, с выполнением 2-х независимых реакций с меченными флюорофором аллель-специфическими праймерами: 4 - FAM/HEX/TexasRed/Cy5 для кодонов 136 (A/V) и 154 (R/H) и 3 - FAM/HEX/TexasRed для кодона 171 (R/H/Q) (M.Van Poucke, J. Vandesompele, M.Mattheeuws, A.Van Zeveren and L.J.Peelman A dual fluorescent multiprobe assay for prion protein genotyping in sheep // BMC Infectious Diseases. - 2005. V.5. - P.5-13), с последующей их детекцией с использованием прибора реал-тайм ПЦР iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, USA). С использованием данного метода возможна диагностика 5 различных аминокислот в 3-х позициях гена, но в нем не разработана технология анализа аминокислот 136Т и 171К.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа генодиагностики устойчивости овец к скрепи, обеспечивающего прижизненную диагностику резистентности овец к патогенному приону на уровне генотипа и повышающего ее точность при сокращении затрат на выполнение анализа.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ генодиагностики устойчивости овец к скрепи, предусматривающий проведение амплификации (ПНР-анализа) фрагмента гена прионового протеина овец, включающего 3 основных информативных кодона - 136, 154, 171, и отличающийся тем, что после проведения ПЦР-анализа подготовленные ампликоны гибридизируют с секвенирующими праймерами и диагностируют нуклеотидную последовательность гена в трех наиболее информативных кодонах (136, 154 и 171) в режиме реального времени с одновременным определением 7 аминокислот (A, R, Q, Н, V, Т и К) с применением технологии пиросеквенирования и выявлением генотипов, отнесенных к 5-ти классам генетической устойчивости овец к скрепи (G1-G5).

Генодиагностику устойчивости овец к скрепи выполняли следующим образом:

1) исходя из последовательности гена прионового протеина овец, соответствующему аллелю "дикого типа" были подобраны олигонуклеотидные праймеры, 5'-конец одного из которых мечен биотином, амплифицирущие участок гена PrP овец длиной 262 пар оснований (п.о.) (генный банк AY326330) (фиг.1):

262Sc for (позиции 372-389) - 5'-AGCCCAGTAAGCCAAAAACC-3'

262Sс rev bio (позиции 622-641) - 5'-BIO-GTGTGTTGCTTGACTGTGATGT-3';

2) выполняли 44 цикла ПНР в 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 1xПЦР буфер (16.6 мМ (NH₄) ₂SO₄, 67.7 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl₂), 200 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: 1 цикл - 96°С 10 мин, 44 цикла последовательно - 96°С - 0,5 мин, 58°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин;

3) проверку результативности прохождения ПЦР диагностировали методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 1,5% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1xТАЕ буфере 20 мин при 120 V и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ);

4) оставшиеся 45 мкл амплификатов делили на 2 аликвоты по 20 мкл и смешивали в круглодонных пластиковых 96-луночных плашках с 3 мкл сефарозы (Streptavidin Sepharose , 17-5113-03) и 57 мкл связывающего буфера (Binding Buffer, 40-0033), инкубировали при комнатной температуре 10 мин, интенсивно перемешивая на шейкере при 1400 rpm/мин;

5) с использованием вакуумной рабочей станции (Vacuum Prep Workstation (220-240 V), 60-0207) связанные с сефарозной матрицей ПЦР-продукты переносили на препарационные фильтры и последовательно промывали по 10 сек в 70% этиловом спирте, 0,2 М NaOH (для денатурации ДНК), 1х промывочном буфере (Wasching Buffer, 40-0035). После отключения вакуума пробы 5-10 сек элюировали в подготовленные тонкостенные пластиковые 96 луночные плашки (PSQ 96 Plate Low, 40-0010), содержащие в каждой лунке 45 мкл Annealing Buffer (40-0036) в смеси с 15 пикомолями секвенирующих праймеров, подобранных к местам мутаций в аминокислотах 136, 154 и 171 гена прионового белка овец. Нами были выбраны три секвенирующих праймера: Sc seq136 5'-GCTACAGTCGTGGAAG-3' и Sc seq154 5'-CTATGAGGACCGTTACTAT-3'(дуплекс); и Sc seq171 5'-TGTACTACAGACCAGTGGAT-3' (мультиплекс), и разработана схема анализа, позволяющая одновременно определять полиморфизм амплифицированного участка гена PrP овец в позициях 2 кодонов 136 и 154 (дуплекс), а также в позициях 1, 2 и 3 кодона 171 (мультиплекс) (фиг.2). Для диагностики в 136 кодоне треонина (Т), образующегося при замене первого нуклеотида триплета GCC ACC, мы предложили использование одного секвенирующего праймера Sc seq136 5'-GCTACAGTCGTGGAAG-3';

6) подготовленные таким образом пробы помещали в термостат, инкубировали 2 мин при 90°С для гибридизации секвенирующих праймеров с одноцепочечной ДНК-матрицей, по окончании охлаждали при комнатной температуре в течение 10 мин;

7) генодиагностику проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQ 96MA SYSTEM (Pyrosequencing AB) с использованием реагентов из набора PSQ 96 SNP Reagent Kit 5х96 (40-0023) в режиме реального времени. Для идентификации нуклеотидной последовательности ДНК каждого конкретного индивидуума в позициях 2 аминокислот 136/154 (дуплекс) разработали следующую схему раскапывания азотистых оснований и считывания результатов - CGAGTGTCGATGCAT; для кодона 171 с идентификацией каждого из трех нуклеотидов триплета - TCAGTGATAG, для диагностики треонина в кодоне 136 - CTGAGTCGATG;

8) обработку «сырых» данных пиросеквенирования изучаемых SNP проводили с использованием программного обеспечения PSQ96MA SNP software v.2.0. Определенные таким образом для каждого животного аллели суммировали в электронной таблице Microsoft Excel. Полученная матрица генотипов служила основой для статистической обработки результатов.

Пример. Контрольное использование предложенного способа для генодиагностики разводимых пород овец России на устойчивость к скрепи было апробировано на 875 животных 19 популяций 13 пород (табл.1).

Таблица 1
Частоты встречаемости аллелей гена PrP у различных пород овец России.
Направления продуктивности	Породы	Число голов, n	Частоты аллелей, %
			ARR	ARQ	AHQ	ARH	VRQ	TRQ*	ARK*
Тонкорунные	Асканийская	30	61.67	38,33	0	0	0	0	0
	Советский меринос	68	40,44	47,06	7,35	0,74	4,41	0	0
	Ставропольская *	103	30,10	58,25	4,37	2,43	3,88	0	0,97
	Грозненская	85	28,23	60,00	4,12	4,12	3,53	0	0
	Волгоградская	39	29,49	65,38	1,28	0	3,85	0	0
Полутонкорунные	Цигайская	65	30,77	55,38	0,77	2,31	10,77	0	0
	Русская длинношерстная	47	53,19	36,17	2,13	1,06	7,45	0	0
	Ромни-марш	95	31,05	61,05	5,26	1,06	1,58	0	0
Грубошерстные	Каракульская *	127	27,17	61,02	1,97	5,51	0	2,76	1,58
	Эдильбаевская	51	8,82	72,55		18,63	0	0	0
	Калмыцкая	21	11,9	64,29	2,38	21,43	0	0	0
	Кучугуровская	52	8,66	89,42	1,92	0	0	0	0
	Романовская	92	2,17	88,59	3,80	0	5,44	0	0
	Итого животных	875
* редкие аллели

Были диагностированы как наиболее часто встречающиеся аллели ARR, ARQ, AHQ, ARH, VRQ, так и выявлены 2 редко встречающихся аллеля гена прионового белка овец TRQ и ARK. Во всех исследованных породах был выявлен наиболее предпочтительный аллель ARR, ответственный за резистентность к скрепи. Частота встречаемости аллеля ARR варьировала от 61,67% в асканийской до 28,23% в грозненской породах. Грубошерстные породы овец, кроме каракульской, отличались низкой частотой встречаемости аллеля ARR. Наименьшая частота встречаемости данного аллеля была отмечена у овец романовской породы - 2,17%. В 8-ми из 13-ти породах овец был диагностирован скрепи-чувствительный аллель VRQ с частотой встречаемости в интервале 1,58%-10,77% у овец пород ромни-марш и цигайская соответственно. Аллель ARK определен у 2 животных ставропольской и 3 каракульской пород. Каракульская порода уникальна еще и тем, что только в ней нет животных с нежелательным аллелем VRQ, и, напротив, выявлены 7 животных с редчайшим аллелем TRQ.

В зависимости от диагностированных аминокислот в позициях 136/154/171 животные были ранжированы на 5 классов генотипов устойчивости к скрепи (табл.2, 3).

Таблица 2
Шкала классов генотипов устойчивости овец к скрепи.
Классы	PrP генотип	Сокращение	Возможности использования в селекции
G1	ARR/ARR	ARR/ARR	Резистентные, наиболее желательны для разведения и селекции
G2	ARR/AHQ	ARR/XXX	Наличие ARR-аллеля позволяет использовать в разведении.
	ARR/ARH
	ARR/ARQ
G3	AHQ/AHQ	ХХХ/ХХХ	Вследствие отсутствия ARR-аллеля нежелательно использовать для разведения, но отсутствие аллеля VRQ позволяет использовать их в воспроизводстве в особых случаях.
	AHQ/ARH
	AHQ/ARQ
	ARH/ARH
	ARH/ARQ
	ARQ/ARQ
G4	ARR/VRQ	ARR/VRQ	Для сохранения редких пород допускается использование в разведении при индивидуальном подборе родительских пар.
G5	VRQ/ARH	VRQ/XXX VRQ/VRQ	Наличие наиболее чувствительного к скрепи аллеля VRQ не допускает использование животных для дальнейшего разведения.
	VRQ/AHQ
	VRQ/ARQ
	VRQ/VRQ

В 10-ти из 13-ти исследованных породах выявлены животные со скрепи резистентным генотипом AR-R/ARR (G1), что является необходимым условием для проведения дальнейшей селекционной работы в рамках повышения естественной устойчивости овец к скрепи.

Таблица 3
Классы генотипов устойчивости российских пород овец к скрепи.
Породы	Классы генотипов устойчивости к скрепи *					ARH/ARK	ARQ/ARK	ARK/ ARK	ARR/ TRQ	ARQ/TRQ
	G1	G2	G3	G4	G5
Тонкорунные
Асканийская	36,67	50,00	13,33	0	0	0	0	0	0	0
Советский меринос	17,65	44,12	30,88	1,47	5,88	0	0	0	0	0
Ставропольская *	7,77	42,72	39,80	1,94	5,83	0,97	0,97	0	0	0
Грозненская	10,59	35,29	47,06	0	7,06	0	0	0	0	0
Волгоградская	10,26	38,46	46,15	0	5,13	0	0	0	0	0
Полутонкорунные
Цигайская	13,85	24,61	40,00	9,23	12,31	0	0	0	0	0
Русская длинношерстная	42,55	25,53	17,02	12,77	2,13	0	0	0	0	0
Ромни-марш	7,37	44,21	45,26	2,11	1,05	0	0	0	0	0
Грубошерстные
Каракульская *	4,72	41,73	45,67	0	0	0	1,58	0,79	3,15	2,36
Эдильбаевская	1,96	13,73	84,31	0	0	0	0	0	0	0
Калмыцкая	0	23,81	76,19	0	0	0	0	0	0	0
Кучугуровская	0	17,31	82,69	0	0	0	0	0	0	0
Романовская	0	4,35	84,78	0	10,87	0	0	0	0	0
* восстанавливаемая порода

Максимальное процентное соотношение животных класса G1 было выявлено в 2-х породах - русской длинношерстной и асканийской, что составило соответственно 42,55 и 36,67%. В 4-х породах (советский меринос, грозненская, волгоградская, цигайская) число животных, относящихся к первому классу, находилось на уровне 10-18%. У овец ставропольской породы и ромни-марш данный показатель составил чуть больше 7%. Число животных с генотипом ARR/ARR в каракульской и эдильбаевской породах было минимальным (4,72 и 1,96% соответственно), а в таких породах, как калмыцкая, кучугуровская, романовская не было выявлено вовсе. В 5-ти породах - одной тонкорунной (асканийская) и четырех грубошерстных (каракульская, эдильбаевская, калмыцкая, кучугуровская) отсутствуют животные с нежелательными генотипами, которые относятся к классам G4 и G5. Число животных с редкими генотипами, устойчивость которых к скрепи неизвестна и которые вынесены нами в группу GX, составило 1,94% в ставропольской породе и 7,88% в каракульской.

Предложенный способ может быть использован в биотехнологии сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма гена PrP овец с целью последующего использования полученных результатов в популяционной генетике, разведении и селекции овец.