средство, обладающее геропротекторной активностью, и способ его получения

Формула изобретения

1. Средство, обладающее геропротекторной активностью, характеризующееся тем, что оно выполнено в виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл и получено из эпифиза (шишковидной железы) телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.

2. Способ получения средства, обладающего геропротекторной активностью, характеризующийся тем, что эпифиз (шишковидную железу) телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее -40°С, выдерживают при температуре -20÷22°С в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3%-ный раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°С, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1%-ный раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7÷16°С, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3÷5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее двух раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см ² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН 5,6÷6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см² , разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см ².

Описание изобретения к патенту

Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к выделению биологически активного вещества из эпифиза (шишковидной железы) и получению лекарственной формы для парентерального введения, которая может использоваться в медицине как средство, обладающее геропротекторной активностью.

Известно, что терапевтический потенциал многих пептидных препаратов проявляется в стимуляции иммунных и репаративных процессов. Пептиды вызывают метаболические изменения, управление которыми осуществляется через механизмы генной регуляции [Khavinson V.Kh.Malinin V.V.Gerontological Aspects of Genome Peptide Regulation. - Basel: Karger, 2005. - 104 p.]. Известны иммуностимуляторы пептидной природы: тактивин (патент Франции №2570278), тимозин (Goldstein a. L. et.al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1972, v.69, p.1856-1863). Эти препараты и представляют собой набор полипептидов различной длины, воздействующих на различные звенья иммунного ответа, а также на другие физиологические функции организма, что ведет к появлению нежелательных побочных эффектов.

Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (а.с. SU №1218521, 1994; а.с. SU №1227198, 1986; патент РФ №1298879, 1993; патент РФ №1448443, 1994; патент РФ №1522486, 1993; патент РФ №2075944, 1997; патент РФ №2161501, 2001; а.с. SU №1522486, 1993; патент US №4341765; патент GB №1161896, 1969; патент FR №2583982, 1987).

Известен способ получения пептидного комплекса из эпифиза или шишковидной железы крупного рогатого скота, включающий экстракцию измельченного сырья 3-5% уксусной кислотой с добавлением хлористого цинка, центрифугирование, осаждение целевого продукта из надосадочной жидкости шестью объемами ацетона и эфира, его ренатурацию в 1%-ной уксусной кислоте с последующим осветлением и приготовлением лекарственной формы (патент РФ №944191, 1994).

Известен способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, обладающих геропротекторным действием, из эпифиза мозга животных (патент РФ №2163129, 2000), являющийся наиболее близким аналогом - прототипом для предлагаемого средства.

Согласно способу, описанному патенте РФ №2163129, комплекс биологически активных полипептидов получают путем измельчения эпифиза, экстракции 3% раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывания органическим растворителем, причем экстракцию проводят при температуре 7÷15°С в течение 48 часов, рН 3,0÷4,0, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, обработку надосадочной жидкости ацетоном проводят в соотношении 1:5 при t=5°C, отстаивают до образования сформировавшегося осадка, надосадочную жидкость сифонируют, полученный осадок промывают ацетоном в соотношении 1:(15-20), отстаивают до осветления надосадочной жидкости и сифонируют ее, осадок фильтруют и промывают ацетоном при комнатной температуре, высушивают и готовят водный раствор с содержанием пептидов 15-35 мг/мл, полученный раствор перемешивают, центрифугируют, затем высокомолекулярные водорастворимые фракции отделяют ультрафильтрацией через материалы с задерживающей способностью до 15000 Да, полученный целевой продукт лиофилизируют.

Целевой продукт, полученный способом, описанным в патенте РФ №2163129, содержит комплекс полипептидов с молекулярной массой от 1000 до 12000 Да, является наиболее близким аналогом - прототипом для предлагаемого средства, обладающего геропротекторной активностью.

К недостаткам известного способа следует отнести извлечение в процессе экстракции из ткани эпифиза большого количества (более 70%) веществ непептидной природы, которые, являясь примесями, не определяют геропротекторную активность выделенного активного вещества, а также его низкий выход.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача разработки способа получения средства, обладающего геропротекторной активностью, в виде лекарственной формы для парентерального введения, выделенного из эпифиза (шишковидной железы) телят не старше 12-месячного возраста или свиней, техническим результатом которого является оптимальная технология выделения пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да и получение водного раствора экстракта с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, позволяющая не только очистить получаемый продукт от примесей, но и увеличить его выход.

Экспериментальная проверка показала, что предлагаемый способ обеспечивает фармацевтическую стабильность, максимальную биологическую ценность и терапевтическую эффективность средства, обладающего геропротекторной активностью, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.

Другим аспектом изобретения является средство, обладающее геропротекторной активностью, в виде лекарственной формы для парентерального введения, представляющее собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, технический результат которого заключается в том, что выделенное вещество отличается от известных веществ, полученных ранее из эпифиза животных, по молекулярной массе входящих в него пептидных компонентов, а также по его нетоксичности и апирогенности за счет полной очистки от примесей.

В ходе исследований в экспериментах на животных выявлено, что полученный водный раствор средства с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл является терапевтически эффективной дозой, что позволяет считать показанным использование средства при различных видах возрастной патологии. Это подтверждается приводимыми ниже примерами.

В процессе проведения исследований была установлена важность следующих стадий способа получения средства, обладающего геропротекторной активностью, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения (далее - препарат):

- повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее двух раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона до получения осадка светло-серого цвета, что свидетельствует о полной очистке осадка от примесей, таких как липидные, белковые, фосфолипидные и другие;

- получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см ² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да и добавлении в ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН=5,6÷6,6;

- стерилизующая фильтрация, ампулирование и автоклавирование в течение 8 минут при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см² , что обеспечивает стабильность препарата при сохранении терапевтической эффективности.

Режим и время автоклавирования были установлены экспериментально.

Необходимо отметить, что предлагаемое средство, обладающее геропротекторной активностью, отличается от известных биологически активных веществ, выделенных ранее из эпифиза животных, поскольку представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, выделенных из эпифиза, в то время как препарат, полученный способом, описанным в патенте РФ №2163129, содержит в своем составе преимущественно комплекс полипептидов с молекулярной массой от 1000 до 12000 Да.

Указанный технический результат достигается тем, что средство, обладающее геропротекторной активностью, выполнено в виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл и получено из эпифиза телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.

Указанный технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения средства, обладающего геропротекторной активностью, характеризуется тем, что эпифиз (шишковидную железу) телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус 20-22°С в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20°±5°С, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7÷16°С, затем перемешивают по 1 часу через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3÷5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее двух раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН=5,6÷6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см², разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 минут при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см².

Сущность изобретения поясняется чертежом и таблицами.

На чертеже представлено влияние препарата на развитие эксплантатов эпифиза.

В Таблице 1 представлено влияние препарата на продолжительность жизни и возникновение опухолей у самок мышей SAMP.

В Таблице 2 представлено влияние препарата на продолжительность жизни и возникновение опухолей у самок мышей SAMR.

В Таблице 3 представлено влияние препарата на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.

В Таблице 4 представлена динамика субъективных показателей у больных с климактерическим синдромом.

В Таблице 5 представлена динамика изменения содержания гормонов гипофиза в сыворотке крови больных с климактерическим синдромом

Изобретение иллюстрируется следующими примерами: пример 1 - способ получения препарата; примеры 2 и 3, подтверждающие геропротекторную активность препарата; пример 4 - изучение токсичности препарата; пример 5, подтверждающий терапевтическую эффективность препарата, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.

Пример 1. Способ получения препарата

В качестве сырья используется эпифиз мозга (шишковидная железа) телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней, который замораживают при температуре не менее минус 40°С и выдерживают при температуре минус 20÷22°С в течение не менее двух месяцев.

В реактор для экстракции перекачивают 400 л 3% раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры (20±5)°С, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 80 кг измельченного до получения гомогенной массы сырья. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси добавляют в нее 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры плюс 7÷16°С, затем перемешивают по 1 часу через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч.

Экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием при (5000±500) об/мин в течение 1 ч. К экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5. Выдерживают при температуре плюс 3÷5°С в течение 4 ч. Образовавшийся осадок гомогенизируют и повторно осаждают ацетоном не менее двух раз. Затем осадок, содержащий активное веществе, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета. Промытый осадок протирают через металлическое сито, выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают двойным слоем ткани хлопчатобумажной и высушивают при периодическом помешивании в вытяжном шкафу до полного удаления запаха ацетона.

Выход активного вещества (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из эпифиза) составляет 50 г на 1 кг исходного сырья.

Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 40 мин до концентрации пептидов 2,5÷2,9 мг/мл. Полученный раствор центрифугируют при (3000±200) об/мин в течение (20±5)мин. Центрифугат фильтруют через фильтр типа АР-15 или аналогичный.

Фильтрат подвергают ультрафильтрационной очистке на установке для ультрафильтрации при противодавлении не более 1,0 кгс/см ², через материалы с задерживающей способностью 15000 Да.

В ультрафильтрат добавляют расчетную навеску гликокола до его конечной концентрации 10÷20 мг/мл, перемешивают до полного растворения гликокола при сохранении рН=5,6÷6,6.

Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, которую проводят под давлением, не превышающим 2,0 кгс/см².

Полученный раствор разливают в ампулы по 2,0 мл и автоклавируют, причем ампулы с препаратом подвергают стерилизации в течение 8 минут при температуре 120°С и атмосферном давлении не более 1,1 кгс/см².

Препарат представляет собой бесцветный, прозрачный раствор и содержит пептидный комплекс с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл.

Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к содержимому 1 ампулы препарата 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Прозрачность раствора свидетельствует об отсутствии высокомолекулярных белковых компонентов.

Для определения в препарате пептидных связей к его раствору добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате пептидных связях.

С целью определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле.

Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 270±5 нм.

Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют следующими методами:

методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 («Pharmacia», Швеция). Для калибровки колонки 1,6×60 см используют Peptide Molecuar Weight Kit MS III («Serva», Германия);

методом масс-спектрометрии. Спектры получают на времяпролетном масс-спектрометре Voyager DE Biospectrometry с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (MALDI-TOF) при относительной интенсивности азотного лазера 2300-2400, ускоряющем напряжении 25000 В, времени задержки 90 нс и давлении в вакуумной камере 2,6×10 ⁶ тор;

методом электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков.

Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят полипептиды с молекулярной массой от 70 до 212 Да.

С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Lichrosorb C18», колонка 2×62 мм) установлено, что в состав препарата входят преимущественно низкомолекулярные фракции - от 70 до 90%, а высокомолекулярные компоненты в препарате отсутствуют.

Пирогенность препарата определяют на кроликах общепринятым методом (ГФ XI, вып.2, с.183) при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Показано, что препарат является апирогенным.

Таким образом, вышеизложенным способом получен препарат - лекарственная форма для парентерального введения, представляющая собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.

Пример 2. Влияние препарата на развитие эксплантатов эпифиза

Эксперименты проведены на 52 фрагментах эпифиза крыс линии «Wistar» с массой тела 150÷200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл). Добавляют препарат в концентрациях 2, 10, 20, 50, 100 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента эпифиза. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

На чертеже представлено влияние препарата на развитие эксплантатов эпифиза. Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации препарата 20 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 35%, по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов эпифиза на более длительных сроках культивирования (7 дней) было выявлено аналогичное стимулирующее действие препарата в той же концентрации.

Таким образом, в отношении ткани эпифиза препарат оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.

Пример 3. Влияние препарата на продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у мышей с ускоренным старением (SAM)

Одной из наиболее перспективных экспериментальных моделей для изучения механизмов старения и канцерогенеза являются генетически модифицированные мыши SAM (senescence accelerated mice). В результате возникающего повреждения генома интенсивность спонтанного мутагенеза у мышей SAMP (SAM prone), наиболее предрасположенных к ускоренному старению, значительно выше, чем у мышей других линий, включая и "дикую линию" SAMR (SAM resistant).

В эксперименте было изучено влияние препарата на показатели продолжительности жизни и развития опухолей у мышей SAMP и SAMR. В качестве препарата сравнения использовали мелатонин. Двухмесячных животных каждой линии (111 самок SAMP и 95 самок SAMR) разделили на 4 группы. Мыши 1-й группы являлись интактным контролем. Животным 2-й группы (контроль с растворителем) вводили подкожно курсами (ежедневно в течение одной недели каждый месяц) по 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Мыши 3-й группы получали в таком же режиме мелатонин в ночное время (с 20:00 до 8:00) с питьевой водой в концентрации 20 мг/л. Мышам 4-й группы по такой же схеме, как мышам 2-й группы, вводили подкожно исследуемый препарат в двух разовых дозах 1,5 мкг (70 мкг/кг) и 7 мкг (350 мкг/кг) в 0,1 мл стерильного физиологического раствора, для чего животные 4-й группы были разделены на 2 подгруппы.

При сравнении динамики гибели мышей SAM разных линий выявлены признаки ускоренного старения мышей SAMP (Таблица 1 и Таблица 2).

При этом в Таблице 1 и Таблице 2 приняты следующие сокращения СПЖ - средняя продолжительность жизни; - константа в уравнении Гомпертца; MRDT - время удвоения смертности; # - общее количество опухолей (лимфом и фиброзных гистиоцитом), в скобках указано количество фиброзных гистиоцитом.

У животных этой сублинии отмечено уменьшение средней продолжительности жизни последних 10% особей и максимальной ее продолжительности, увеличение показателя скорости старения популяции и уменьшение времени удвоения смертности. Значительных различий в средней продолжительности жизни у интактных мышей SAMP и SAMR обнаружить не удалось.

Исследуемый препарат и мелатонин не оказывали статистически достоверного влияния на среднюю продолжительность жизни мышей обеих сублиний. В то же время, и препарат, и мелатонин проявили геропротекторный эффект у мышей SAMP. Так, мелатонин увеличивал у животных сублинии SAMP продолжительность жизни последних 10% мышей. У них возросла также максимальная продолжительность жизни, в 1,56 раза уменьшились величина константы, отражающей скорость старения популяции, и время удвоения смертности. Применение исследуемого препарата сопровождалось увеличением на 1,5 мес (8%) средней продолжительности жизни 10% максимально проживших мышей, и на столько же максимальной продолжительности их жизни. Дозировка препарата не влияла на выраженность его геропротекторного действия.

Основной причиной смертности животных обеих сублиний являлось развитие лимфом, связанное с происхождением мышей SAM от высоколейкозной линии AKR. Для злокачественных лимфом у мышей SAM характерным было существенное увеличение размеров печени, селезенки, тимуса и поражение подмышечных, паховых и мезентериальных лимфатических узлов с инфильтрацией их опухолевыми клетками с многочисленными митозами. В печени очаги лимфомы обычно располагались вокруг кровеносных сосудов. Кроме злокачественных лимфом у животных обнаруживали злокачественные фиброзные гистиоцитомы в виде опухолевых узлов, располагавшихся под кожей и прораставших в окружающие ткани. Опухоли состояли из атипичных веретенообразных клеток с множественными митозами и разрастаниями фиброзной ткани. У части мышей отмечены также кисты яичников, представляющие собой тонкостенные образования, заполненные фибрином или геморрагическим содержимым.

При анализе влияния исследуемого препарата и мелатонина на канцерогенез показано, что у мышей SAMP мелатонин не повлиял на частоту развития опухолей и срок их обнаружения. Исследуемый препарат не изменял частоту новообразований и существенно (в 1,7 раза) увеличивал продолжительность жизни особей, у которых опухоли не развились (Таблица 1).

У мышей SAMR применение исследуемого препарата и мелатонина не оказывало влияния на частоту развития злокачественных новообразований, а также на продолжительность жизни животных с опухолями или без них (Таблица 2). Однако под действием исследуемого препарата достоверно увеличивалась средняя продолжительность жизни мышей.

Таким образом, препарат оказывает выраженное действие на механизмы старения и канцерогенеза, замедляя темп старения и снижая частоту развития злокачественных опухолей. При этом одинаково эффективными оказались дозы препарата 70 мкг/кг и 350 мкг/кг, что свидетельствует о широте терапевтического действия препарата и обоснованности выбора терапевтически эффективной дозы, не превышающей 70 мкг/кг.

Пример 4. Изучение токсичности препарата

Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 66 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 18÷21 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 35 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 150 мг/кг, 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.

Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 70 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150÷180 г.Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата на 84 морских свинках-самцах массой 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат в течение 6 мес. в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl.

В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 300-3000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала введения препарата достоверного изменения показателей не выявлено (Таблица 3).

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Следовательно, препарат, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.

Пример 5. Эффективность применения препарата у больных с климактерическим синдромом

Проблема состояния здоровья людей старшего возраста приобретает особое значение для женщин 45 лет и старше, поскольку в этом возрасте у них происходит перестройка функционирования эндокринной системы, нередко сопровождающаяся патологическими проявлениями. Известно, что возрастное снижение функциональной активности эпифиза вызывает нарушение механизмов взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем и способствует развитию различных заболеваний и патологических состояний. На фоне начинающегося общего старения организма у женщин происходит угасание функций репродуктивной системы, обусловленное нарушением функционирования яичников, гипофиза, гипоталамуса и надгипоталамических структур мозга. Это проявляется значительным снижением гормональных резервов яичников и повышением порога чувствительности гипоталамуса и гипофиза к воздействию эстрогенов, что приводит к нарушению правильного ритма секреции фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов. Эти инволюционные изменения репродуктивной системы постепенно приводят к угасанию детородной функции, а затем и гормональной.

Клинические испытания эффективности применения препарата были проведены у 28 пациенток в возрасте от 47 до 62 лет с климактерическим синдромом. Больные предъявляли жалобы на приливы жара к голове и верхней части туловища, сопровождаемые повышенным потоотделением, головную боль и изменения артериального давления, боли в области сердца, озноб, приступы тахикардии в покое, склонность к обморочным состояниям, тошноту, чувство «замирания» сердца, головокружение, слабость. Психоэмоциональные расстройства чаще всего проявлялись раздражительностью, плаксивостью, беспокойством, нарушением сна, снижением памяти и внимания, быстрой утомляемостью, сниженной работоспособностью. Пациентки отмечали увеличение частоты возникновения респираторных инфекционных заболеваний. При лабораторном обследовании у пациенток были выявлены нарушения гормонального статуса, характеризующиеся снижением содержания ФСГ и ЛГ в периферической крови. Общеклинические и биохимические показатели в крови не выходили за пределы возрастной нормы.

Пациентки были разделены на 2 группы. В основную группу вошли 15 больных, получавших препарат в дозе 5 мг в 2 мл физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.

Контрольная группа состояла из 13 аналогичных больных, которым назначалось только общепринятое лечение, включающее в себя комплекс витаминов, кавинтон, клофелин, настойку валерианы или пустырника. Гормонозаместительная терапия не применялась у больных обеих групп. Изучение эффективности применения препарата проводили на основе общепринятых методов исследования. В динамике оценивали жалобы больных, проводили общеклиническое и биохимическое исследование крови. Содержание гормонов (ФСГ и ЛГ) в сыворотке крови определяли радиоиммунологическим методом.

В процессе применения препарата у пациенток с климактерическим синдромом отмечалось улучшение субъективных показателей, что проявлялось в достоверном, по сравнению с показателями у больных до лечения, уменьшении приступов болей в области сердца, головокружения, чувства «замирания» сердца, улучшении сна. Кроме того, достоверно по сравнению с показателями у больных до лечения и с показателями у больных после лечения с применением общепринятых средств уменьшилось количество жалоб на приступы тахикардии, потоотделения, приливы жара к голове и верхней части туловища, колебания артериального давления (Таблица 4). Пациентки отмечали после курса применения препарата существенное повышение работоспособности, которое они связывали с нормализацией психоэмоционального состояния.

Обращает на себя внимание, что эффект препарата характеризовался устойчивым последействием. Так, через 1 месяц после окончания курсового приема препарата такие симптомы, как головокружение, шум в ушах, общая слабость, повышенная утомляемость, тазовые дисфункции, нарушение сна и цефалгии, практически нивелировались. Исследование содержания гормонов в сыворотке крови больных, применявших препарат, выявило достоверное снижение исходно повышенного содержания ФСГ по сравнению с показателями, как до лечения, так и после лечения общепринятыми средствами при отсутствии достоверных изменений концентрации ЛГ (Таблица 5). Проведенное исследование свидетельствует о корригирующем влиянии препарата на гормональный дисбаланс у больных с климактерическим синдромом.

Таким образом, полученные результаты исследования свидетельствуют о нормализующем влиянии препарата в терапевтически эффективной дозе 5 мг (2,5 мг/мл) на гормональный обмен, что позволяет считать целесообразным его применение в комплексном лечении климактерического синдрома и профилактике ускоренного старения, проявляющегося в негативном течении климактерического периода у женщин.

Таблица 1
Средство, обладающее геропротекторной активностью, и способ получения
Показатель	Интактные мыши	Контроль (0,9% NaCl)	Мелатонин	Препарат
Количество мышей	24	33	24	30
Продолжительность жизни (сут): Средняя	468±0	537±26	516±40	582±20
Медиана	513	582	525	569
Последние 10%	662±7	693±6	748±2*, **	741±9*,**
Максимальная	669	702	750* ,**	759*,**
(сут-1)	0.0100	0.0101	0.0064* ,**	0.0102
MRDT (сут)	69	68	109*,**	68
Количество мышей с опухолями	16(67%)	20(61%)	16(67%)	22(73%)
Количество злокачественных опухолей #	18(2)	22(2)	16(0)	23(3)
СПЖ (сут) мышей-опухоленосителей	473:131	615±49*	520±98	555±35
СПЖ (сут) мышей без опухолей	462±62	374±69	405±85	584±84**
Количество мышей с кистой яичника	8(33%)	15(45%)	11(46%)	16(53%)
* - Р<0,05 по сравнению с показателем у интактных мышей;
** - Р<0,05 по сравнению с показателем в контроле.

Таблица 2
Средство, обладающее геропротекторной активностью, и способ получения
Показатель	Интактные мыши	Контроль (0,9% NaCl)	Мелатонин	Препарат
Количество мышей	14	33	19	29
Продолжительность жизни (сут): средняя	488±58	521±29	433±26	546±32*
медиана	498	508	397	556
последние 10%	704	738±14*	603±0**	671±8
максимальная	704	766	603	727
(сут-1)	0.0066	0.0076	0.0102	0.0126
MRDT (сут)	105	91	68	55
Количество мышей с опухолями	11(79%)	20(67%)	13(68%)	22(76%)
Количество злокачественных опухолей #	11(0)	20(0)	14(1)	23(1)
СПЖ (сут) мышей-опухоленосителей	516±139	541±43	478±51	545±48
СПЖ (сут) мышей без опухолей	415±46	445:1:28	385±41	461±45
Количество мышей с кистой яичника	4(29%)	13(43%)	5(26%)	19(66%)
* - Р<0,05 по сравнению с показателем у интактных мышей;
** - Р<0,05 по сравнению с показателем в контроле.

Таблица 3
Средство, обладающее геропрртекторной активностью, и способ получения
Показатель	Введение препарата (10 мг/кг)
	3 месяца		6 месяцев
	Контроль (n=21)	Препарат (n=21)	Контроль (n=21)	Препарат (n=21)
Эритроциты, ×10 12/л	5,3±0,5	5,2±0,5	5,1±0,2	5,3±0,4
Гемоглобин, г/л	14,3±1,1	14,1±1,5	14,2±1,4	14,2±1,1
Ретикулоциты, %	1,3±0,02	1,2±0,04	1,1±0,07	1,2±0,06
Тромбоциты, ×109/л	143,7±7,6	142,7±6,4	145,1±7,4	144,3±6,2
Лейкоциты, ×109 /л	9,6±0,4	9,5±0,2	9,4±0,7	9,5±0,2
Нейтрофилы палочкоядерные, %	0,31±0,03	0,30±0,05	0,33±0,04	0,30±0,03
Нейтрофилы сегментоядерные, %	43,6±2,4	44,4±2,1	43,5±1,8	45,1±2,5
Эозинофилы, %	0,71±0,07	0,67±0,05	0,72±0,04	0,69±0,08
Базофилы, %	0,67±0,04	0,68±0,03	0,72±0,08	0,65±0,06
Моноциты,%	2,4±0,05	2,2±0,07	2,3±0,05	2,2±0,06
Лимфоциты, %	49,2±2,5	50,3±1,9	53,1±2,0	47,7±2,7
СОЭ, мм/ч	1,84±0,06	1,78±0,07	1,76±0,09	1,91±0,05
Резистентность эритроцитов, % NaCl
-максимальная	0,40±0,04	0,41±0,06	0,42±0,04	0,43±0,08
-минимальная	0,32±0,03	0,30±0,03	0,30±0,05	0,33±0,02
Общий белок в сыворотке крови, г/л	72,5±1,9	71,6±2,5	73,4±2,3	70,5±3,2
Натрий в сыворотке крови, ммоль/л	153,7±5,7	155,4±6,8	152,4±6,3	154,6±7,2
Калий в сыворотке крови, ммоль/л	5,2±1,8	5,0±2,8	5,3±2,3	5,1±2,0

Таблица 4 Средство, обладающее геропротекторной активностью, и способ получения
Показатель		Количество больных, %
		До лечения		После лечения с применением общепринятых средств		После лечения с применением препарата
Приливы жара к голове и верхней части туловища		77,0		51,3*		23,2*#
Повышенное потоотделение		65,1		52,4*		21,3* #
Головные боли		61,6		46,4		38,2*
Изменение артериального давления		65,0		49,3		25,8*#
Боли в области сердца		55,9		35,2*		26,9*
Приступы тахикардии		66,9		34,6*		23,7*
Головокружение		48,2		32,6		24,9*
Слабость		60,3		41,6		35,4
Чувство «замирания» сердца		55,1		24,0*		21,6*
Быстрая утомляемость		77,9		51,4*		38,3*
Сниженная работоспособность		88,2		51,6*		38,4*
Раздражительность		91,4		58,9*		32,0**
Плаксивость		67,9		41,5*		22,6*#
Нарушение сна		74,1		36,4*		25,3*
Снижение памяти и внимания		54,2		39,0		33,6
* Р<0,05 по сравнению с показателем у больных до лечения; # Р<0,05 по сравнению с показателем у больных после лечения с применением общепринятых средств.
Таблица 5
Показатель	До лечения		После лечения с применением общепринятых средств		После лечения с применением препарата
ФСГ, нг/мл	71,0±4,6		65,7±4,0		48,9±4,1* #
ЛГ, нг/мл	10,2±1,1		12,6±1,9		11,0±1,5
* Р<0,05 по сравнению с показателем у больных до лечения;
# Р<0,05 по сравнению с показателем у больных после лечения с применением общепринятых средств.