способ индуцирования мутаций у растений

Формула изобретения

Способ индуцирования мутаций у растений, включающий обработку семян мутагеном, облучение потоком отрицательных аэроионов с последующей промывкой в проточной воде и высушиванием, отличающийся тем, что в качестве мутагена используют раствор перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1, которым обрабатывают семена в течение 5-10 ч, при этом концентрация перекиси водорода составляет 1-2 ммоль, а концентрация маннитола 4-5 ммоль.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений, и может быть использовано в мутационной генетике для создания новых сортов растений.

Известен способ индуцирования мутаций у растений, включающий обработку семян мутагеном, с последующей промывкой в проточной воде и высушиванием. Семена подвергают предварительной обработке сульфатом железа (II) с концентрацией 4-5 ммоль в течение 5-10 ч с последующим облучением их потоком отрицательных аэроионов на расстоянии 23-25 см в течение 40-80 мин (RU №2004111628, МПК⁷ А01Н 1/04, опубл. 20.10.2005 г.).

Недостатком известного способа является следующее: при существующем режиме воздействия сульфатом железа (II) снижается всхожесть семян и выживаемость растений 1-го поколения.

Технический результат заключается в увеличении выхода хромосомных аббераций с одновременным повышением жизнеспособности семян путем повышения прооксидантного и антиоксидантного эффекта.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе индуцирования мутаций у растений, включающем обработку семян мутагеном, облучение потоком отрицательных аэроионов с последующей промывкой в проточной воде и высушиванием, в качестве мутагена используют раствор перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1, которым обрабатывают семена в течение 5-10 ч, при этом концентрация перекиси составляет 1-2 ммоль, а концентрация маннитола 4-5 ммоль.

Если концентрация перекиси водорода менее 1 ммоль, то снижается ее мутагенное действие, а также прооксидантный эффект. Концентрация перекиси водорода более 2 ммоль приводит к угнетению жизненных функций семян. Концентрация маннитола менее 4 ммоль понижает антиоксидантный эффект, более 5 ммоль ингибирует мутагенное действие перекиси водорода.

Время обработки семян перекисью водорода и маннитолом не должно превышать 10 ч, так как более длительная обработка негативно влияет на процесс прорастания семян. Обработка семян менее 5 ч приводит к уменьшению выхода хромосомных аббераций.

Способ осуществляют следующим образом.

Воздушно-сухие семена обрабатывают раствором перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1 в течение 5-10 ч. Концентрация перекиси водорода составляет 1-2 ммоль, концентрация маннитола 4-5 ммоль. Затем семена промывают в проточной воде и далее воздействуют на них потоком отрицательных аэроионов. Для этого семена помещают под электроэффлювиальный ионизатор воздуха, который образует отрицательно заряженный кислород (супероксид анион-радикал кислорода) в процессе тихого разряда без примесей озона и положительных аэроионов. Семена помещают на расстоянии 23-25 см от электроэффлювиального ионизатора. Содержание аэроионов, определенное в месте обработки, составляет при 70-80 мин 2,7 млн в 1 см³.

При проведении цитогенетического анализа показано, что наибольший выход аберрантных клеток при действии перекиси водорода и маннитола, стимулирующей процессы пероксидации, выход аберрантных клеток повышается на 33% по сравнению с контролем. В таблице показано увеличение выхода хромосомных аберраций, что характеризует данный подход как эффективный в получении исходного материала при селекции. В исследованиях во всех вариантах опыта отмечена зависимость между увеличением содержания МДА (малоновый диальдегид) и выходом аберраций хромосом. Как следует из таблице после действия прооксиданта активность СОД (супероксида дисмультазы) и каталазы резко снижается, а содержание МДА резко повышается. Обработка ионизированным воздухом в течение 40 мин приводит к увеличению активности СОД и каталазы, снижению количества МДА в проростках лука.

В качестве (антиоксиданта) используют маннитол с концентрацией 4-5 ммоль, который при обработке ионизированным воздухом в присутствии перекиси водорода (прооксиданта) с концентрацией 1-2 ммоль повышает выход хромосомных аберраций в клетках апикальной меристемы проростков лука, активируя антиоксидантные ферменты и снижая содержание МДА (таблица 1).

Перекись водорода играет важную роль в процессах окисления, так как является источником образования наиболее мощного из известных в биосистемах окислителей - гидроксильного радикала ОН*-, образующегося в ходе реакций Фентона (1) и Хабера-Вайса (2):

Эти две реакции являются основными источниками гидроксильных радикалов, обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью, вклад которых в повреждение ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), инициируемое перекисью водорода и ионизированным воздухом, понижается.

Семена высевают для выращивания первого поколения (M₁) после обработки, во втором поколении (М₂) получают измененные растения, в третьем поколении проверяют мутационную (наследственную) природу, отбирают мутации и рассчитывают их частоту по известным методикам экспериментального мутагенеза, например, на 100 семей М₂. В основе реализации мутагенного эффекта лежит имитация природного процесса ограниченной свободнорадикальной модификации ДНК активными формами кислорода. При этом применение маннитола позволяет сводить к минимуму появление в ходе реакции Фентона гидроксильного радикала, модулируя тем самым мутагенный эффект активных форм кислорода.

семена	Время облучения, мин	Клетки с аберрациями, %	СОД, ус.ед/мг белка	Каталаза, мкат/л	МДА, ммоль	Всхожесть, %
Замоченные в воде(контроль)	0	2,20±0,04	0,11±0,03	13,16±0,82	1,4±0,09	40,3±0,33
	40	1,23±0,05*	2,29±0,08**	29,91±0,38*	0,6±0,08*	87,6±1,20*
	60	1,60±0,01*	0,63±0,08*	14,89±0,87***	1,31±0,12*	77,6±1,20*
	80	2,56±0,01*	0,38±0,04*	14,27±0,61*	1,74±0,07*	68,1±1,00*
Обработанные раствором перекиси водорода	0	2,93±0,05	0,66±0,02	36,56±0,49	1,66±0,14	34,3±0,33*
	40	1,57±0,05*	1,85±0,01*	63,01±0,57*	0,74±0,03*	85,1±1,00*
	60	1,89±0,04*	0,32±0,06*	55,52±1,56**	1,73±0,01*	79,1±0,58*
	80	2,95±0,06*	1,31±0,03*	51,93±1,27**	2,84±0,03*	67,1±0,58*
Обработанные раствором маннитола и перекиси водорода	0	2,21±0,12	0,87±0,18	64,17±1,98	1,43±0,26	48,1±0,66*
	40	1,25±0,21***	2,33±0,11**	110,65±5,46**	0,63±0,17***	94,5±0,88*
	60	1,62±0,14***	1,51±0,31**	99,58±1,36*	1,57±0,23***	81,1±0,66*
	80	1,76±0,09***	1,15±0,18**	87,71±1,54*	1,60±0,14***	75,4±0,33*
Отличие от контроля достоверно при *р<0,001, **р<0,01, ***р<0,05