способ подготовки растений земляники садовой (fragaria l.), размноженных in vitro, к условиям культивирования ex vitro

Формула изобретения

Способ подготовки размноженных in vitro растений земляники садовой (Fragaria L.) к условиям культивирования ex vitro, включающий подготовку растений in vitro, отличающийся тем, что растения выдерживают на питательной среде с 4-10% сахарозы 20-60 дней в темноте при температуре от 1 до 10°С, а затем переносят в почвенный субстрат.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к садоводству, и может быть использовано в питомниководстве для подготовки растений, размноженных in vitro, к условиям культивирования ex vitro.

Биотехнологические системы широкомасштабного ускоренного размножения in vitro оздоровленного посадочного материала предполагают интенсивное использование биологически активных веществ цитокининового действия (бензиламинопурин - БАП и др.), известных как препараты, задерживающие старение листьев растений (Кулаева О.Н. "Цитокинины и их физиологическое действие" // "Успехи современной биологии", 1967, Т.63, №1, С.28-53; Кулаева О.Н. "Цитокинины, их структура и функция", М.: "Наука", 1973).

Использование 6-бензиламинопурина (БАП) для культивирования растений на искусственных питательных средах in vitro с целью интенсификации размножения растений может приводить к реювенилизации растительного материала и задержке цветения растений земляники садовой после пересадки их в грунт (Mohamed F., Swartz H.J., Buta J.G. "The role of abscisic acid and plant growth regulators in tissue culture-induced rejuvenation of strawberry ex vitro" // Plant cell, Tissue and Organ Culture, 1991, V.25 №1, pp.75-84).

Известно, что в генеративных органах растений наблюдают повышенное содержание Сахаров (Миляева Э.Л., Комарова Э.Н. "Содержание сахаров в стеблевых апексах рудбекии двуцветной в период эвокации цветения" // Физиология растений, 1988, Т.35, вып.1, с.187-189; Э.Л.Миляева, Э.Н.Комарова, В.Г.Кочанков. "Эвокация цветения и содержание углеводов в стеблевых апексах Rudbeckia bicolor при переходе к цветению в полной темноте" // Физиология растений, 1996, Т.43, №2 с.299-302; B.M.Lamp, J.H.Connel, R.A.Duncan, M.Viveros, V.S.Polito. "Almond Flower Development: Floral Initiation and Organogenesis // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 2001, V.126, №6, pp.689-696).

Кроме того, после культивирования на питательных средах дополненными высокими концентрациями сахаров существенно возрастает резистентность растительного материала к глубоким стрессовым воздействиям (Высоцкая О.Н., Попов А.С. "Способ криосохранения меристем, изолированных из растений земляники садовой (Fragaria L.) in vitro" / Патент №2220563, C1, 2004).

Существует способ стимуляции цветения растений in vitro. В этом способе из стеблей цветущих растений табака получали каллус, который формировал бутоны на питательной среде если концентрация глюкозы в ней достигала 3,5-6,5% (Константинова Т.Н., Баврина Т.В., Аксенова Н.П., Голяновская С.А. "Действие глюкозы на морфогенез стеблевых каллусов фотопериодически нейтрального табака Трапезоид" //Физиология растений, 1972, Т.10, Вып.1, с.89-98).

Недостатком этого способа является то, что в нем предлагают использовать редуцирующий сахар: глюкозу, которая легко окисляется и вводить которую в питательную среду желательно через специальные фильтры после этапа автоклавирования (холодный способ стерилизации). Данный способ можно считать аналогичным решением поставленной перед нами задачи.

Наиболее близким техническим решением является способ перевода размноженных in vitro растений в нестерильные условия, заключающийся в том, что растения земляники с корнями или же без корней сразу после культивирования in vitro (свет, 23°С) на питательной среде, содержащей 6-бензиламинопурин (0,5 мг/л), индолилмасляную кислоту (0,1 мг/л) и стандартное количество сахарозы (30 г/л), переносили в нестерильные условия, где эти растения укоренялись и адаптировались к нестерильным условиям (Bozena Borkowska Morphological and physiological characteristics of micropropagated strawberry plants rooted in vitro or ex vitro // Scientia Horticulturae, 2001, V.89, P.195-206).

Недостатком данного способа мы считаем отсутствие эффекта стимуляции формирования генеративных органов у растений земляники ex vitro.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является такая подготовка растений, размноженных in vitro, которая позволяет им не только успешно адаптироваться к нестерильным условиям, но и быстро переходить ex vitro в генеративное состояние.

Поставленная задача решается тем, что перед перенесением в почвенный субстрат размноженные in vitro растения помещают на агаризованную питательную среду с 4-10% сахарозы, выдерживают 20-60 дней в темноте при температуре от 1 до 10°С.

Суть настоящего изобретения в том, что предлагаемый способ подготовки размноженных in vitro растений земляники садовой (Fragaria L.) к условиям ex vitro, заключающийся в помещении этих растений на агаризованную питательную среду с 4-10% сахарозы и выдерживании их 20-60 дней в темноте при температуре 1-10°С, позволяет не только подготовить растения к пересадке в нестерильные условия, но и стимулировать ex vitro вегетативную и генеративную продуктивность этих растений (таблица 1; таблица 2, приложение: фиг.1, фиг.2).

Изобретение иллюстрируется следующим примером:

Пример 1

Растения земляники садовой (Fragaria L.) сорта Роксана (Roxana) размножают in vitro на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга (Murashige Т., F.Skoog. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum, 1962, 15, P.473-497), дополненной 6-бензиламинопурином (1 мг/л) и индолилуксусной кислотой (0,1 мг/л) и 30 г/л сахарозы.

Полученные в результате размножения растения с корнями или же без корней in vitro на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга без индолилуксусной кислоты и бензиламинопурина, дополненной 4-10% сахарозы, помещают на 20-60 дней в темноту при температуре 1-10°С.

После этого растения земляники пересаживают в почвенную смесь в теплице, а затем переносят в полевые условия.

Из высаженных в почвенную смесь растений более 95% оставались живыми и в теплице до перенесения в полевые условия формировали не только усы, но и цветки (Приложение, фиг.2).

После перенесения в полевые условия данные растения земляники образовывали генеративных органов на 55-56% больше, а вегетативных органов на 38-77% больше, чем те, которые перед перенесением в нестерильные условия культивировали на среде с 3% сахарозы (табл.1, табл.2).

После перенесения в полевые условия данные растения земляники образовывали на 67-68% больше генеративных органов, а вегетативных органов на 43-92% больше, чем те, которые перед перенесением в нестерильные условия культивировали на среде с 3% сахарозы (табл.1, табл.2).

Таблица 1. Влияние способа подготовки к высадке в грунт растений in vitro на генеративную продуктивность ex vitro земляники садовой (Fragaria L.) сорта Роксана.
Вариант	Среднее количество цветоносов на одно растение	Среднее количество генеративных образований на одно растение
Контроль*	18,0±2,2 (100%)	78,9±9,8 (100%)
Способ**	28,0±2,2 (156%)	122,2±9,7 (155%)
* Подготовка растений in vitro на среде с 3% сахарозы при 20-28°С и 16-часовом дне.
** Подготовка растений in vitro 20-60 дней в темноте при 1-10°С на среде с 4-10% сахарозы.

Таблица 2. Влияние способа подготовки к высадке в грунт растений in vitro на вегетативную продуктивность ex vitro земляники садовой (Fragaria L.) сорта Роксана.
Вариант	Среднее количество листьев		Среднее количество усов		Среднее количество розеток
	2003	2004	2003	2004	2003	2004
Контроль*	22,9±2,8 (100%)	50,6±5,5 (100%)	10,0±1,3 (100%)	-	24,1±3,8 (100%)	34,5±4,8 (100%)
Способ**	35,9±3,0 (157%)	70,0±7,4 (138%)	17,7±1,5 (177%)	-	37,3±4,4 (155%)	47,6±5,6 (138%)
* Подготовка растений in vitro на среде с 3% сахарозы при 20-28°С и 16-часовом дне.
** Подготовка растений in vitro 20-60 дней в темноте при 1-10°С на среде с 4-10% сахарозы.

Техническим результатом заявленного способа является то, что пребывание in vitro 20-60 дней в темноте при температуре от 1 до 10°С на питательной среде с 4-10% сахарозы стимулирует генеративную и вегетативную продуктивность размноженных in vitro растений земляники садовой (Fragaria L.) в первые годы культивирования ex vitro (табл.1, табл.2) и даже ускоряет их цветение (фиг.1, фиг.2). Этот эффект можно проиллюстрировать тем, что в расчете на одно растение возрастают следующие показатели: среднее количество цветоносов на 56%, среднее количество генеративных образований на 55%, среднее количество листьев на 38-57%, среднее количество усов на 77%, а среднее количество розеток на 38-55%.