штамм bifidobacterium gallinarum гб, испосльзуемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к кормам, ферментированных и неферментированных кормов, предназначенных для профилактики и лечения кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственной птицы

Формула изобретения

Штамм Bifidobacterium gallinarum ГБ (коллекционный №178 в Государственной коллекции микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека), используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к кормам, ферментированных и неферментированных кормов, предназначенных для профилактики и лечения кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственной птицы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности и ветеринарии и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов и биологически активных добавок к кормам, заквасок, ферментированных и неферментированных кормов, предназначенных для лечения и профилактики кишечных заболеваний у молодняка сельскохозяйственной птицы.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бифидобактерий для профилактики и лечения кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственной птицы. Поставленная задача была достигнута путем выделения из содержимого слепых отростков кишечника 100-дневного здорового цыпленка расы "Хайсек браун" на птицефабрике ОАО "Снежка" Брянской обл., штамма бифидобактерий Bifidobacterium gallinarum ГБ.

Штамм Bifidobacterium gallinarum ГБ (коллекционный №178 государственной коллекции микрофлоры человека ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека) для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к кормам, ферментированных и неферментированных кормов, предназначенных для профилактики и лечения кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственной птицы. Штамм Bifidobacterium gallinarum ГБ характеризуется следующими признаками:

1. Культурально-морфологические признаки

В жидких питательных средах (кукурузно-лактозной, печеночной, гидролизатно-молочной, казеиново-дрожжевой) с добавлением 0,75-1% агара растет по всему объему, кроме зоны аэробиоза, накапливая биомассу к 16-18 часам до 11,3 lg КОЕ/мл (с незначительными колебаниями) и закисляя среду до рН 4,7-3,8. Отдельные колонии имеют грушевидную форму. Сквашивает молоко с образованием плотного сгустка через 18-20 часов.

Температура культивирования составляет 37±1°С. Не растет при температуре 46,5°С. При микроскопии 16-часовой культуры клетки представляют собой грамположительные палочки, расположенные скоплениями или цепочками. После 2-7-суточного хранения культур в мазках наблюдаются особи кокковидной формы.

2. Физиолого-биохимические признаки

Облигатный анаэроб. Ферментирует лактозу, L-арабинозу, D-глюкозу, сахарозу, мальтозу, D-галактозу, слабо ферментирует L-рамнозу; не расщепляет маннит, сорбит, дульцит.

3. Данные молекулярно-генетического анализа

Заявляемый штамм имеет общие и индивидуальные полосы в картине полимеразноцепной реакции (ПЦР). Общей с одновременно исследованными пятью видами бифидобактерий (B.adolescentis, B.bifidum, В.breve, B.longum, B.infantis) является полоса размером 850 вр, а специфичными для заявленного штамма служат полосы размером 150 и 250 вр.

4. Кислотообразующая активность

В процессе культивирования на производственных питательных средах и молоке образует органические кислоты в концентрациях, указанных в таблице 1.

Таблица 1. Данные культивирования и кислотообразующей активности штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ
Питательные среды	Количество продуцируемой кислоты (в градусах Тернера)
Кукурузно-лактозная	165
Казеиново-дрожжевая	150
Гидролизатно-молочная	196
Молоко обезжиренное	190

5. Антагонистическую активность штамма изучали методом совместного культивирования с тест-штаммами, послужившими причиной гибели или болезни домашней птицы. Штаммы были выделены из крови погибших цыплят, содержимого кишечника больных кур и комбикормов. Было использовано 18 тест-штаммов, в числе которых были Proteus vulgaris. Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, лактозонегативные E.coli и др.

Обнаружена высокая антагонистическая активность штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ в отношении сальмонелл, стафилококков, псевдомонад, лактозонегативных кишечных палочек, вызывающих развитие функционального и деструктивного дисбактериоза (таблица 2).

Таблица 2. Антагонистическая активность штамма В.gallinarum ГБ.
№ п/п	Наименование культур, источник выделения	Наличие роста в разведениях, lg КОЕ/мл
		Совместное культивирование				Контроль
		10-2	10-3	10 -4	10-5	10-7	10-8
1.	Ps.aeruginosa №1-95, комбикорм					+	+
2.	Ps.aeruginosa №3-95, комбикорм					+	+
3.	Ps.aeruginosa №8-95, комбикорм					+	+
4.	Ps.aeruginosa №6-84, труп курицы					+	+
5.	Ps.aeruginosa №11-92, воздух	-	-	-	-	+	+
6.	Ps.aeruginosa №3-92, труп цыпленка	2,36	3,23	4,7		+	+
7.	Ps.aeruginosa №1-84, труп цыпленка	2,46	3,17			+	+
8.	Ps.aeruginosa №159, музейный	-	-	-	-	+	+
9.	Proteus vulgaris №4, кишечник	-	-	-	-	+	+
10.	Proteus vulgaris №3, кишечник	-	-	-	-	+	+
11.	S.enteritidis №7-98, комбикорм	-	-	-	-	7,9	8,3
12.	S.enteritidis №5-98, комбикорм	-	-	-	-	8,04	8,9
13.	S.infantis, комбикорм	-	-	-	-	7,84	8,47
14.	E.coli №5-00, труп цыпленка	-	-	-	-	8,07	8,77
15.	E.coli №1-00, труп цыпленка	-	-	-	-	8,25	8,84
16.	E.coli №7-00, труп цыпленка	-	-	-	-	8,04	8,41
17.	E.coli, лактозонегативная, кишечник					8,14	8,9
18.	E.coli, лактозонегативная, кишечник					8,14	8,47

6. Адгезивную активность заявляемого штамма изучали в пробной реакции гемагглютинации с 3%-ными взвесями свежих эритроцитов петуха и коровы. Средний показатель адгезии (СПА) рассчитывали по числу прикрепленных клеток бифидобактерий к 50 эритроцитам в одном поле зрения при микроскопии в камере Горяева. Заявляемый штамм обладал высокой степенью адгезии к эритроцитам петуха (таблица 3). В отношении эритроцитов коровы степень адгезии была значительно ниже, что подтверждает зоологическую специфичность культуры заявляемого штамма.

Таблица 3. Адгезивные свойства штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ
Показатели	Эритроциты петуха	Эритроциты коровы
Количество бифидобактерий, прикрепленных к 50 эритроцитам, М±м	273±02,6	28,4±1,03
Средний показатель адгезии (СПА), М±м	5,46±1,3	0,46±0,04

7. Чувствительность к антибиотикам штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ изучалась на модели антимикробных препаратов, применяемых для профилактики и лечения болезней органов пищеварения кур в условиях промышленного птицеводства - тилана и энрофлоксацина, а также гентамицина, хлорамфеникола и окситетрациклина.

Изучение проводили, культивируя культуру заявляемого штамма в полужидкой кукурузно-лактозной среде с добавлением перечисленных антибиотиков в различных концентрациях. Чувствительность к антибиотикам определяли, подсчитывая число КОЕ/мл бифидобактерий после культивирования в конечных серийных разведениях среды и определяя минимальную концентрацию антибиотика (МПК), при которой отмечается рост бифидобактерий. Результаты представлены в таблице 4. Было показано, что штамм проявлял устойчивость к тилану: МПК составлял более 125 мкг/мл. К гентамицину, хлорамфениколу, окситетрациклину и энрофлоктацину МПК превышала 500 мкг/мл. Таким образом, штамм Bifidobacterium gallinarum ГБ является антибиотикорезистентным к широкому спектру антибиотиков, в том числе к самому современному противомикробному препарату - энрофлоксацину.

Таблица 4. Результаты изучения чувствительности штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ к противомикробным препаратам
Наименование противомикробного препарата	Наличие роста бифидобактерий
	Концентрации противомикробного препарата, мкг/мл
	500	250	125	62,5	31,25	15,6	7,8	3,9	1,95
Тилан	-	-	+	+	+	+	+	+	+
Гентамицин	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Хлорамфеникол	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Окситетрациклин	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Энрофлоксацин	+	+	+	+	+	+	+	+	+

Была показана эффективность штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ для профилактики кишечных инфекций у новорожденных цыплят. Для этих целей применялась суточная культура штамма, выращенная на кукурузно-лактозной среде.

Испытания проводили путем выпаивания с водой цыплятам в течение первых трех дней жизни. В испытаниях участвовали две группы цыплят, поголовье которых составило 41140 и 45180 шт.

Контрольные группы составляли цыплята, получавшие энрофлоксацин.

Результаты учитывали по сохранности цыплят и нарастанию живой массы в течение 28 дней. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Изучение эффективности добавки на основе штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ с целью профилактики кишечных инфекций у новорожденных цыплят
Группы цыплят	Поголовье	Сохранность, %	Увеличение сохранности, %	Живая масса, г (М±м)	Увеличение живой массы
1.
Опытная	41140	98,36	4,74	152±4,39	15,14
Контрольная	2876	93	-	129+3,71	-
2.
Опытная	45180	99,35	4,53	149±3,62	12,1
Контрольная	5762	94,82	-	131±5,25	-

Как видно из представленной таблицы, сохранность цыплят в опытных группах составляла 99.35-98-36% и превосходила показатели сохранности в контрольных группах (94,84-93,6%). Увеличение сохранности в первой опытной группе составило 4,74%, во второй - 4,55%. Прирост живой массы у цыплят первой группы составил 15,4%, во второй группе - 12,1%. В контрольных группах прироста массы у цыплят не было отмечено.

Результаты проведенных испытаний показали, что применение добавки на основе заявляемого штамма оказывает на поголовье новорожденных цыплят выраженный профилактический эффект против кишечных инфекций, вызываемых такими возбудителями, как сальмонеллы, лактозонегативные эшерихии, протей. Кроме того, на фоне этого происходит существенный прирост живой массы птицы.

Применение противомикробного препарата энрофлоксацин хоть и оказывает профилактическое действие, но приросту массы у цыплят не способствует. При этом следует отметить, что энрофлоксацин является препаратом противомикробного действия химической природы и употребление человеком в пищу мяса птицы, в котором он содержится, может нанести вред организму и привести к микроэкологическим нарушениях ЖКТ.

Заявляемый штамм Bifidobacterium gallinarum ГБ обладает антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов (псевдомонад, сальмонелл, протея, лактозонегативных эшерихий), послуживших причиной гибели или болезни домашней птицы, устойчив к противомикробным препаратам: тилану, гентамицину, хлорамфениколу, окситетрациклину, энрофлоксацину, является экологически безопасным для человеческого организма, а также обладает высокой биотехнологичностью, культивируется на принятых в производстве питательных средах с высоким выходом активной биомассы.

Показаны его эффективность и экономическая рентабельность при использовании с целью профилактики кишечных заболеваний у новорожденных цыплят: наблюдался не только защитный эффект против возбудителей кишечных заболеваний домашней птицы, но и существенный прирост массы цыплят.

Пример 1. Получение лиофилизированного пробиотического препарата ветеринарного назначения

К суспензии 16-18-часовой культуры бифидобактерий штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ, выращенной на кукурузно-лактозной среде, добавляют защитную среду высушивания (сахароза 80% и желатин 8% в объеме 10-12%) и разливают слоем в лотки, замораживают при -40÷-45°С и лиофильно высушивают из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный сухой концентрат содержит в 1 г сухой биомассы не менее 10⁸ живых клеток бифидобактерий. Такой препарат может служить эффективным средством лечения и профилактики кишечных заболеваний домашней птицы.

Пример 2. Получение жидкой формы пробиотического препарата ветеринарного назначения

Инокулят культуры бифидобактерий штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ в объеме 5-8% вносят в ферментер с кукурузно-лактозной средой и культивируют в течение 8-9 часов при 37,5-38°С. В культуральную жидкость добавляют 0,5% аскорбиновой кислоты и стерильно разливают в емкости. В результате получают биологически активную добавку к корму птицы с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸ в 1 мл. Полученная добавка обладает выраженным пробиотическим и иммунокоррегирующим действием. Добавляется в корм или воду для отпаивания домашней птицы с целью профилактики кишечных заболеваний и дисфункций пищеварения.

Пример 3. Для профилактики дисбактериозов и стимулирования роста биологически активную добавку к корму (БАД) на основе штамма Bifidobacterium gallinarum ГБ выпаивали цыплятам мясного кросса "Иза-15" в дозе 0,2 мл на голову в течение первых трех дней жизни.

Цыплята, получавшие БАД, имели 100%-ную сохранность за период наблюдения. В конце первой недели жизни опытные цыплята статистически достоверно (Р 0,01) превосходили по живой массе контрольную группу на 9,05%. В конце срока наблюдения превосходство по живой массе также было статистически достоверным (Р 0,01) и составляло по сравнению с контролем 12,1%. Увеличение среднесуточного прироста к контролю составил 11,2%, при этом расход корма в опытной группе был меньше и конверсия составляла 2,44, тогда как в контроле - 2,59.

Пример 4.

Пробиотик на основе заявляемого штамма и пробиотик на основе штамма B.adolescentis МС-42 выпаивали цыплятам - петушкам кросса Хайсекс в течение трех дней. Сохранность в течение 21-дневного срока наблюдения 100%. Влияние пробиотиков на рост цыплят представлено в таблице 6.

Таблица 6. Влияние пробиотических препаратов на рост цыплят
№ группы	Условия опыта	Живая масса 10-дневных цыплят, М±м	Достоверность увеличения живой массы, Р	Живая масса 21-дневных цыплят, М±м	Достоверность. увеличения или уменьшения живой массы, Р
1	Пробиотик на основе шт. БГ выпаив. 3 дня	66,8±0,95	Контроль <0,05 Группа 2<0,001	165,25±4,17	Увеличение конт. <0,052 гр. <0,001
2	Пробиотик на основе шт. МС-42 выпаив. 3 дня	59,7±3,14	Уменьшение группа 1.0,01	157,1±10,3	Контроль Р>0,1
3	Контроль	63,6±2,47	-	157,8±5,15	-

Достоверно лучшие результаты роста цыплят отмечали после выпаивания пробиотика на основе штамма ГБ.

В конце первой декады живая масса цыплят первой группы, получавшей пробиотик на основе штамма ГБ - 66,8±0,95 г, что достоверно выше, чем в контрольной (Р<0,05) и во второй группе (Р<0,001), увеличение по сравнению с контролем 5,03%, а по сравнению со второй группой 8,9%.

В возрасте 21 день живая масса первой группы 165,25±4,17 г, что достоверно выше, чем в контроле, (Р<0,05) и во второй группе (Р<0,001). Увеличение живой массы составило 9,5%.

Лучшие результаты динамики роста цыплят первой группы были обусловлены коррегирующим действием пробиотика на основе штамма ГБ на толстокишечный микробиоценоз (таблица 7).

Таблица 7. Показатели микробиоценоза 21-дневных цыплят
Наименование микроорганизмов	Количество микробов lg КОЕ/г (М)
	Норма	Контрольная группа	Опытная 1	Опытная 2
Бифидобактерии	9,77	9,47	10,32	9,97
Лактобактерии	7	7	8,301	7
Эшерихии	7,86	7,86	7,89	7,88
Энтерококки	5,38	5,301	5,301	5,301
Гемолитические бациллы и стафилококки	-	-	-	-
Анаэробные клостридии	5,78	6,07	5,301	5
Протеи	-	-	-	-
Грибы	4,53	-	3,99	4,52

Количество бифидобактерий у цыплят контрольной группы было незначительно меньше нормы, остальные показатели облигатной микрофлоры соответствовали норме, но среди представителей факультативной микрофлоры отмечали увеличение в 10 раз количества анаэробных клостридий.

У опытных цыплят первой группы количество бифидобактерий и лактобактерий было в 10 раз больше нормы, поэтому количественные показатели факультативной микрофлоры соответствовали норме или были ниже.

У цыплят второй опытной группы количество бифидобактерий было незначительно выше нормы, количество лактобактерий, эшерихий, представителей факультативной микрофлоры соответствовало норме. У опытных цыплят отмечали стататистически достоверное увеличение массы зоба за счет уплотнения стенки и слоя слизи на поверхности слизистой в виде налета.

Масса кишечника и печени опытных и контрольных цыплят существенных отличий не имела (таблица 8).

Таблица 8. Масса внутренних органов опытных и контрольных цыплят (М±м), г
Название органа	Опытная 1	Опытная 2	Контрольная
Кишечник	29,0±1,22, Р>0,1	28,4±2,31, Р>0,1	26,5±4,17
Печень	8,5±0,65, Р>0,1	8,46±3,6, Р>0,1	8,25±0,75
Зоб	2,92±0,3, Р<0,01	2,68±0,23, Р>0,1	1,67±0,19

Масса зоба у цыплят, получавших пробиотик на основе штамма ГБ 2,92±0,3 г, получавших пробиотик на основе штамма МС-42 2,68±0,23 г, а у контрольных 1,67±0,19 г, разница была существенной Р<0,01 (таблица 9).

Таблица 9. Микрофлора соскобов слизистой зоба
Наименование микроорганизмов	Количество микроорганизмов lg КОЕ/г (М)
	Опытная 1	% выдел.	Опытная 2	% выдел.	Контроль	% выдел.
Бифидобактерии	3	75	3	50	-	-
Лактобактерии	4 рН 3,82	100	4 рН 3,9	100	4 3,98	100

Лучшее развитие зоба, которое способствовало потреблению большего количества корма, было обусловлено контаминированием слизистой не только лактофлорой, но и бифидобактериями, которых выделяли от 75% обследуемых первой группы и от 50% цыплят второй опытной группы. От контрольных цыплят бифидобактерий не выделялись. Выпаивание цыплятам пробиотика на основе штамма B.gallinarum ГБ не оказывало существенного влияния, также как и выпаивание пробиотика на основе штамма МС-42, на гематологические показатели цыплят: количество эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, СОЭ, гематокрит.

Положительная динамика роста цыплят, получавших пробиотики, была обусловлена более активным фагоцитозом (таблица 10).

Таблица 10. Показатели фагоцитоза опытных и контрольных групп
Группы	Показатели М, м, Р
	Фагоцитарн. индекс ФИ	Фагоцитарн. число ФЧ	% лимфоц./псевдоэозин	Кол-во лейкоцитов	Абсолют. число псевдоэозиноф.	Абсолют. число фагоцит, псевдоэоз	Бактер. емкость крови
Первая опытная	51,5±13,7 Р>0,1	1,32±0,068 Р>0,1	52/30,1	31503,3	9482,4	4892,9	6458,6±817, Р<0,05
Вторая опытная	55±3,53 Р>0,1	1,12±0,29 Р>0,1	52/30	33200	9960	5478	6135,36±825,6, Р<0,05
Контроль	39±7	1,13±0,26	51/30,1	29610	8912,6	3475,9	3927,42±403,25

Фагоцитарный индекс опытных цыплят был выше, чем контрольных, но различия этого показателя были недостоверны.

По процентному соотношению лимфоцитов к псевдоэозинофилам опытные и контрольные цыплята отличались незначительно и эти показатели соответствовали норме. Эозинофилию, характеризующую сенсибилизацию организма к испытуемым препаратам, патологические формы клеток крови не обнаруживали. У опытных цыплят было больше псевдоэозинофилов и фагоцитирующих псевдоэозинофилов, поэтому бактерицидная емкость крови, свидетельствующая о поглотительной активности псевдоэозинофилов, у опытных цыплят была достоверно выше, чем у контрольных (Р<0,05).

Наибольший показатель бактерицидной емкости крови имели цыплята первой группы 6458,6±817. Бактерицидная емкость крови второй группы - 6135,36±825,6, в контроле 3927,42±403,25.

Штамм бифидобактерий ГБ обладал пробиотическим действием, выпаивание в течение трех дней пробиотика, приготовленного на его основе, способствовало заселению и колонизации бифидобактериями слизистой кишечника, слизистой зоба у большинства цыплят, что, в свою очередь, способствовало увеличению потребления корма, усилению всасываемости питательных веществ, активизации фагоцитоза и проявлялось лучшей динамикой роста.

Пробиотическое действие на цыплят штамма ГБ превосходило действие штамма МС-42.