питательная среда для выделения микобактерий

Формула изобретения

Питательная среда для выделения микобактерий, содержащая калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, аминокислоту, агар-агар, глицерин, сыворотку животного, бактерицидный краситель и воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий пировинограднокислый, в качестве аминокислоты - -аминоуксусную кислоту, в качестве бактерицидного красителя - малахитовый зеленый, в качестве сыворотки - сыворотку лошадиную инактивированную при следующем соотношении компонентов, г/л:

Калий фосфорнокислый однозамещенный	2,0-3,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный	1,0-2,0
Магний сернокислый	0,25-0,75
Натрий лимоннокислый	1,0-2,0
Железо лимоннокислое аммиачное	0,03-0,07
-аминоуксусная кислота	0,5-1,5
Натрий пировинограднокислый	0,1-0,2
Агар-агар	2,0-4,0
Сыворотка лошадиная инактивированная	150,0-250,0
Малахитовый зеленый	0,04-0,06
Глицерин	20,0-40,0
Вода дистиллированная	До 1 л

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза.

В последнее время наблюдается рост показателей заболеваемости туберкулезом. В этой связи значительное внимание уделяется лабораторной диагностике туберкулеза.

В настоящее время для выделения (культивирования) микобактерий и определения их чувствительности к лекарственным препаратам используется ряд плотных яичных питательных сред Левенштейна-Иенсена, Финн II [Приказ МЗ РФ от 21.03. 2003 №109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" М., стр.266-270], среда Мордовского [Методические указания МЗ РСФСР "Приготовление и использование новой питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза", М. - 1972].

Недостатком плотных питательных сред являются длительные сроки роста микобактерий при посеве диагностического материала - 2,5-10 недель, а при пересевах культур и определении лекарственной чувствительности - 12-21 день, что затрудняет раннюю бактериологическую диагностику и своевременную коррекцию лечения.

Применение жидких питательных сред позволяет ускорить выявление микобактерий, что важно для раннего начала лечения больных туберкулезом. Известно использование для этих целей жидких сред, содержащих комплекс солей и L-аспарагин в качестве источника азотистого питания: Соттона (Sauton) [B.H.Василев. Микобактериозы и микозы легких. София, 1971 г., стр.156], Школьниковой [Приказ МЗ РФ от 21.03. 2003 №109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации". М., стр.270-271]. Недостатком этих сред является высокая степень проростов посторонней микрофлоры и использование дорогостоящих ингредиентов.

Наиболее близким решением технической задачи данного назначения к заявляемому изобретению является среда для выделения микобактерий туберкулеза Lebek [B.H.Василев. Микобактериозы и микозы легких. София, 1971 г., стр.163], содержащая аспарагин, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, железо лимоннокислое аммиачное, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, глицерин, дистиллированную воду, краситель бромтимоловый синий, агар-агар и говяжью сыворотку крови. Однако эта среда используется в основном для дифференцировки атипичных микобактерий. Входящий в состав питательной среды бромтимоловый синий оказывает тормозящее действие на рост микобактерий туберкулеза, а под влиянием аспарагина возникает конгломеративный рост колоний микобактерий, что осложняет учет результатов исследований.

В основу изобретения поставлена задача повышения ростовых свойств питательной среды.

Поставленная задача решается тем, что в среду, содержащую калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, фактор роста, агар-агар, глицерин, сыворотку животного, бактерицидный краситель и воду, дополнительно вводят в качестве ростового фактора натрий пировинограднокислый, в качестве аминокислоты используют -аминоуксусную кислоту, в качестве бактерицидного красителя - малахитовый зеленый, а основным питательным веществом является инактивированная лошадиная сыворотка. Введение -аминоуксусной кислоты и натрия пировинограднокислого способствует ускорению роста микобактерий с гомогенным их распределением в питательной среде. Инактивация лошадиной сыворотки при 56°С в течение 40 минут снижает ее ингибирующее действие на микобактерии. Бактерицидный краситель малахитовый зеленый обладает оптимальным действием на сопутствующую микрофлору, не вызывая задержки роста микобактерии.

Состав питательной среды при следующих соотношениях, г/л:

калий фосфорнокислый однозамещенный	2,0-3,0
натрий фосфорнокислый двузамещенный	1,0-2,0
магний сернокислый	0,25-0,75
натрий лимоннокислый	1,0-2,0
железо лимоннокислое аммиачное	0,03-0,07
агар-агар	2,0-4,0
сыворотка лошадиная инактивированная	150,0-250,0
малахитовый зеленый	0,04-0,06
глицерин	20,0-40,0
-аминоуксусная кислота	0,5-1,5
натрий пировинограднокислый	0,1-0,2
вода дистиллированная	до 1 л

Среду получают следующим образом.

Пример 1.

1. В 20 мл горячего глицерина растворяют 0,04 г малахитового зеленого.

2. 150 мл лошадиной сыворотки инактивируют при 56°С 40 мин и соединяют с раствором малахитового зеленого.

3. Готовят солевой раствор, для чего в 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют 2,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,25 г магния сернокислого, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,03 г железа лимоннокислого аммиачного, 0,5 г -аминоуксусной кислоты, 0,1 г натрия пировинограднокислого.

Полученный раствор стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм 1 мин и после охлаждения соединяют со смесью 2.

4,2 г агар-агара растворяют в оставшемся количестве дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм 30 мин, соединяют со смесью 3, тщательно перемешивают.

Контроль качества среды осуществляют при посеве тест-штаммов Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv, B-5 и свежевыделенных культур от больных туберкулезом легких. Учет результатов проводят визуально по помутнению среды через 2-8 суток инкубации посевов при температуре 37°С.После 2-8 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что для приготовления смеси 1 используют 30 мл глицерина и 0,05 г малахитового зеленого, для приготовления смеси 2 - 200 мл лошадиной сыворотки, для солевого раствора - 2,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,5 г магния сернокислого, 1,5 г натрия лимоннокислого, 0,05 г железа лимоннокислого аммиачного, 1,0 г -аминоуксусной кислоты, 0,15 г натрия пировинограднокислого, для приготовления раствора 4 - 3 г агар-агара. Далее среду готовят согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что для приготовления смеси 1 используют 40 мл глицерина и 0,06 г малахитового зеленого, для приготовления смеси 2 - 250 мл лошадиной сыворотки, для солевого раствора - 3,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 2,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,75 г магния сернокислого, 2,0 г натрия лимоннокислого, 0,07 г железа лимоннокислого аммиачного, 1,5 г -аминоуксусной кислоты, 0,2 г натрия пировинограднокислого, для приготовления раствора 4 - 4 г агар-агара. Далее среду готовят согласно примерам 1, 2.

После 2-8 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в таблице.

Из таблицы видно, что сроки роста микобактерий туберкулеза на предлагаемой питательной среде сократились по сравнению с прототипом у лабораторного штамма H₃₇Rv в 1,3-1,6 раза, у штаммов, выделенных от больных, в 1,3-1,7 раза и составили в среднем 6 суток. Выявляемость микобактерий туберкулеза из мокроты больных увеличилась при отрицательных результатах бактериоскопии с 27 до 33%, при положительной бактериоскопии с 66 до 78%, при сокращении сроков роста по сравнению с прототипом на 205 суток.

Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает рост микобактерий туберкулеза, что способствует их выявляемости в максимально короткие сроки.

Таблица Характеристика ростовых свойств питательной среды на основании проведенных исследований (1500 пробирочных опытов)
Исследуемый материал	Рост микроорганизмов на питательных средах
	Прототип		Предлагаемая среда по составу
			Минимальный		Средний		Максимальный
	Сроки роста (сутки)	Количество колоний, %	Сроки роста (сутки)	Количество колоний, %	Сроки роста (сутки)	Количество колоний, %	Сроки роста (сутки)	Количество колоний, %
Лабораторный штамм H 37Rv	8	98	6	98	6	100	5	100
Штаммы, выделенные от больных	10	95	8	98	7	98	6	100
Мокрота больных при положительной бактериоскопии	16	66	14	73	14	78	14	78
Мокрота больных при отрицательной бактериоскопии	21	27	16	29	16	32	16	33
Проросты при иследовании мокроты	6	32	7	4	8	2	8	2