внк-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства
Классы МПК: | C12N5/06 клетки или ткани животных |
Автор(ы): | Елисеев Анатолий Константинович (RU), Мельник Николай Васильевич (RU), Зенов Николай Иванович (RU), Литенкова Ирина Юрьевна (RU), Богач Валентина Николаевна (RU), Иванов Виктор Серафимович (RU), Красуткин Сергей Николаевич (RU), Хайкина Людмила Сергеевна (RU) |
Патентообладатель(и): | ОАО "Институт биотехнологий ветеринарной медицины" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-05-31 публикация патента:
10.06.2007 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка. Линия клеток позволяет репродуцировать в промышленных условиях вирус ящура типа А, О, С, Азия, и вирус бешенства «Щелково-51». Изобретение может быть использовано в вирусологии.
Формула изобретения
ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, депонированная в Российской коллекции клеточных культур (РКК), в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН) под №61, предназначенная для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.
Описание изобретения к патенту
Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к области биотехнологии, сфере суспензионного культивирования перевиваемых культур клеток ВНК-21.
Уровень техники.
Характеристика аналогов изобретения:
Перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13, полученная в 1961 году в Англии Максферсоном и Стокером /Macpherson J, Stoker M. - Syrian hamster fibrolast cell line BHK-21 snd its derivatives. - Nature, 1964, 203, 1355-1357/ распространилась по всему Миру.
Из литературных данных /С.Г.Юрков, В.В.Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. -2000 г.- с.59-63/ в нашей стране имеются клетки ВНК-21, поступившие из Англии, Франции, Мексики, США, Швеции и подученные в отечественных профильных учреждениях.
Известны следующие аналоги клеток почки хомячка.
1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита.
2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в НИИС;
3. ВНК-21/2-17а перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток получен во ВНИЯИ (прототип).
ХАРАКТЕРИСТИКА АНАЛОГОВ
1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка поддерживалась в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР /С.Г.Юрков, В.В.Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с.60/.
Среда культивирования. Адаптирована к выращиванию в пристеночных культурах. Клетки отделяют от стекла с помощью 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37°С.
Ростовые свойства. При пересеве с коэффициентом 1:2-1:3 монослой формируется на 2-3 сутки после эксплантации. При условии коррекции рН среды до 7,5-7,6 сформированный монослой сохраняется до 5-6 дней. В литровом матрасе РУ накапливается 40-45 млн. клеток.
Морфология. Клетки фибробластоподобные.
Кариология. Культура резко гетероплоидная с вариабельностью хромосомных наборов от 32 до 78. Стволовую линию (модальный класс) составляют клетки с 40 хромосомами (32-34%), 4-6% клеток в популяции сохраняют диплоидный набор хромосом.
Среда замораживания. Среда культивирования(90%), диметил-сульфоксид (10%).
Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность в пределах 85-95%. Культуры восстанавливают исходные ростовые свойства на 2-3 пассаже.
2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка полученна в НИИС /С.Г.Юрков, В.В.Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с.6-1/.
Среда культивирования. Для суспензионного выращивания применяют среду Игла-MEM, обогащенную 120 мг/л серина и 610 мг/л глутамина с добавлением 0,25% ГЛА и 10% сыворотки крови КРС. При пристеночном культивировании употребляют среду Игла MEM (90%) и сыворотку КРС (10%) рН 7,5-7,6.
Способ поддержания. Поддерживается в суспензионных условиях в реакторах различной емкости. Сохранила способность расти в пристеночных культурах. В этом случае при очередном пассировании клеточный пласт диспергируют 0,25% раствором трипсина, подогретого до 37°С.
Ростовые свойства. В суспензионной культуре при посеве в концентрации 500 тыс. клеток на мл. обеспечивает 3-4 кратный прирост популяции на 3-4 сутки роста. При коэффициенте пересева 1:3 монослой формируется в пристеночных культурах на 2-3 сутки после посева и переживает не более 3-х дней.
Морфология. Клетки эпителиоподобные.
Кариология. Популяция гетероплоидная с разбросом числа хромосом в клетках от 20 до 78. Модальный класс составляют клетки с диплоидным набором хромосом (16-24%).
Среда замораживания. Ростовая среда (90%), диметилсульфоксид (10%).
Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность на уровне 88-96%. Культуры восстанавливаются на 1-2 пассаже.
Характеристика прототипа, выбранного заявителем
3. ВНК-21/2-17а перевиваемый монослойно-суспеизионныч клон клеток /С.Г.Юрков, В.В.Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с.62/ получен во ВНИЯИ и хранится в жидком азоте на уровне 13 пассажа.
Среда культивирования. 0,25% мышечный гидролизат на растворе Эрла (для монослойных культур) и раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением 5 аминокислот (аргинин, глутамин, метеонин, цистин, серии), согласно прописи модифицированной среды Игла и 8 витаминов группы В, сыворотка КРС (5%), рН среды 6,8-7,2.
Способ поддержания. Суспензионную культуру выращивают объемно-доливным методом. Монослойную культуру в пристеночных сосудах любой емкости. При очередном пересеве применяют смесь 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1.
Ростовые свойства. Через 48 часов культивирования в суспензии культура дает 6-7 кратный прирост, достигая конечной концентрации 2,3-2,8 млн/мл. При выращивании в монослое при посевной концентрации 50-100 тыс.клеток на мл. среды монослой образуется на 2-3 сутки роста.
Морфология. В суспензии культура представлена одиночными блестящими, округлыми клетками. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой.
Кариология. Культура гетероплоидная. Модальный класс представлен клетками с 42 хромосомами, составляющими в популяции 28-40%.
Среда замораживания. Ростовая среда (90%), диметилсульфоксид (10%).
Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность 85-90%, клетки восстанавливают морфологию и ростовые свойства на 2-3 пассаже.
Чувствительность к вирусам. Культура клеток чувствительна к вирусу ящура типа А, О, С, Азия.
Раскрытие изобретения.
(1) Сведения, раскрывающие сущность изобретения.
1.2. Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение.
Культура клеток ВНК-21/13-02 предназначена для репродукции в промышленных условиях вируса ящура типа А, О, С, Азия, вируса бешенства шт."Щелково-51", используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.
Клетки ВНК-21/13-02 характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве 7,01 g ТЦД 50/мл, при содержании иммуногенного компонента до 1 млг/мл, а также чувствительны к вирусу бешенства, обеспечивая титр инфекционности 6,5 ЛД50/мл.
Сущность изобретения
"ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка", адаптированная к суспензионному способу выращивания с использованием питательной среды для суспензионного выращивания на основе солевого раствора Хенкса, содержащая 5-7% сыворотки, 0,125% гидролизата мышечных белков и 0,125% гидролизата лактальбумина с добавлением пяти аминокислот: 1-аргинина 0,042 г/л; 1-глутамина 0,584 г/л; 1-тирозина 0,02 г/л; 1-триптофана 0,015 г/л; 1-цистина 0,032 г/л и семи витаминов группы В: холин-хлорид 0,0034, пантотенат кальция (B5) 0,0034, пиридоксаль HCl 0,0034, тиамин (B1) 0,0034, мезо-инозит 0,0068, никотинамид (РР) 0,0034, рибофлавин (B2 ) 0,00034, фолиевая кислота (B9) 0,0034.
ВНК-21/13-02 депонирована в Российской коллекции клеточных культур (РКК) (СЖК РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.
Происхождение. Перевиваемая линия клеток ВНК-21 клон 13, поступила на Щелковский биокомбинат из Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИиТИБП), который получил эту линию из лаборатории цитологии Московского научно-исследовательского института вирусных препаратов в 1972 г.
Морфология. В суспензии культура представлена одиночными округлыми клетками с небольшим количеством конгламератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой, иногда образуется единый цитоплазматический пласт без границ между клетками с наличием большого количества ядер. Отмечается присутствие 2-3-4 и более ядерных симпластов, лежащих изолированно или в структуре клеточного пласта. Также отмечается отпочковывание ядер от общей ядерной массы и формирование микроядер в результате разрушения ядра. Часть клеток отделяется от стекла и растет в суспензии.
Способ культивирования
Монослой клеток ВНК-21/13-02 выращивают в матрацах любой емкости. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного версена в соотношении 1:9 при температуре 37°С. Клетки снимают бесцентрифужным методом и ресуспендируют в ростовой среде до посевной концентрации.
В суспензии культуру клеток выращивают отъемно-доливным способом в течение 48 часов до 10-50 последовательных пассажей.
Условия культивирования
Суспензионное культивирование проводят в реакторах емкостью 4-40-100-600 литров с рабочим объемом 3-30-60-450 литров соответственно при следующих параметрах:
- посевная концентрация 0,4-0,5·10 6 кл/мл;
- скорость перемешивания 25-40 об/мин;
- температура культивирования 36,0-36,5°С;
- рН среды в пределах 6,6-7,1;
- аэрация путем барботирования воздухом 0,5-1,5 л/л среды.
Индекс пролиферации при суспензионном культивировании равняется 6-8, достигая концентрации к 48 часам 4·106 кл./мл при жизнеспособности 95-99%.
Пассаж 32 пассажа в роллерном монослое, 13 пассажей в суспензии. Клеточная суспензия расфасована в ампулы по 2 см 3 с концентрацией 7·106 кл/мл.
Кариологическая характеристика: кариотип суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствуют кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы. В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с числом хромосом, совпадающим с диплоидным (n=44).
Видовая идентичность. Культура идентифицирована как ткань почки сирийского хомячка.
Криоконсервация, жизнеспособность после консервации. Для длительного хранения (-196°С) используют ампулы, при хранении (-70°С) - флаконы. Консервирование клеток проводят в питательной среде (73%), сыворотке (20%), криопротектор диметилсульфоксид (7%). Замораживание суспензии клеток по 2-х ступенчатому режиму понижения температуры от 0 до минус 30°С со скоростью 1°С в минуту, от минус 30°С до минус 70°С со скоростью 4-6°С в минуту. Охлажденные до минус 70°С ампулы с суспензией клеток помещают на хранение в сосуды Дьара с жидким азотом -196°С, предварительно подержав ампулы в парах азота. Жизнеспособность клеток после консервации 85-97%.
Описание способа получения линии клеток.
В качестве исходного материала использовали перевиваемую линию клеток ВНК-21 клон 13, поступившую на Щелковский биокомбинат из Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИиТИБП), который получил эту линию из лаборатории цитологии Московского научно-исследовательского института вирусных препаратов в 1972 г.
Адаптацию клеток к суспензионным условиям культивирования проводили в биоферментере MD-300 фирмы "MARUBISHI" (Япония) с автоматическим поддержанием концентрации водородных ионов (рН 6,9-7,0), температуры (37°С), ручным регулированием подачи воздуха и скорости перемешивания (до 100 об/мин). Культивирование проводили, используя питательную среду на основе раствора Хенкса, содержащей 0.25%-тов суммы гидролизатов лактальбумина и мышечных белков, 7%-тов сыворотки кр. рог. скота, пяти аминокислот и витаминов группы В.
В первых трех пассажах отмечали некоторое уменьшение численности популяции к концу культивирования, что требовало увеличить засевную концентрацию клеток до 500 тыс./мл. Последующие пять пассажей клетки росли с образованием довольно значительных клеточных конгламератов, появлением зернистости в цитоплазме. При дальнейшем пассажировании, с 9-го по 13 пассаж, число конгламератов уменьшалось, цитоплазма становилась прозрачной и гомогенной. Посадочную концентрацию снизили до 200 тыс./мл, популяция клеток в суспензии увеличивалась в 6-7 раз, время генерации составило 48 часов.
После проведения 13 пассажей в суспензии были получены клетки, отличающиеся однообразием морфологии и размера, с небольшим количеством конгламератов и высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 5-7). Консервирование клеток осуществили в криосреде (ростовая среда - 73%, сыворотка - 20%, диметилсульфоксид - 7%), в ампулах по 2 мл с концентрацией 7 млн.кл./мл. Замораживание проводили по двухступенчатому режиму понижения температуры от 0 до -30°С со скоростью 1°С/мин и от -30 до -70°С со скоростью 4°С/мин. Охлажденные до -70°С ампулы с суспензией клеток поместили на хранение в сосуд Дъюара с жидким азотом (-196°С), предварительно выдержав их в парах азота. Жизнеспособность клеток после консервации составила 98%.
Культура клеток прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-89 "Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности".
Данные кариологического анализа, проведенного методом Moorhead P.3. et al 1960 г., адаптированной суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствуют кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы.
В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с числом хромосом, совпадающим с диплоидным (n=44).
Полученный трофовариант клеток ВНК-21/13-02 отличается высокой пролиферативной активностью. Концентрация клеток, выращенных в среде, содержащей 0,25% гидролизата и 7% сыворотки, составила 1,5-3,0 млн.кл./мл в биореакторах промышленных объемов.
ВНК-21/13-02 депонирована в Российской коллекции клеточных культур (РКК) в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН).
Класс C12N5/06 клетки или ткани животных