консервант для хранения бактерий

Формула изобретения

Применение 5-метил-3-фенил-2,4-диэтоксикарбонил-N(4-метилфенил)-циклогекса-1,5-диениламина в качестве консерванта для хранения бактерий.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, в частности к хранению бактерий, и может быть использовано в научной и практической медицине, в биотехнологии и пищевой промышленности для хранения штаммов - продуцентов различных веществ.

Известны составы сред, применяемые при консервировании микроорганизмов. Среда "Mist dissicans" (Сэджер Р. «Цитоплазматические гены и органеллы», М., Мир, 1975, 423 с.), содержащая 7,5% глюкозы, 3 ч. нормальной лошадиной сыворотки и 1 ч. бульона.

Недостатком данной среды следует признать отсутствие стандартности ее приготовления в силу наличия в ней лошадиной сыворотки и бульона, приготовленного из сырья различного качества,

Сахарозожелатиновая среда (Данилова М.В., Надирова И.М., Кудрявцев В.И. «Лиофилизация бактерий», В кн.: Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов.- М.: Наука, 1967, с.131), содержащая 10% сахарозы и 0,1% агара в 1,5% желатине.

Недостатком данной среды является невозможность хранения различных бактериальных штаммов в течение длительного времени.

Известны защитные среды (патенты РФ №2088657, МПК C12N 1/04; №2045573, МПК C12N 1/04; №2041942, МПК C12N 1/04), используемые для лиофилизации штаммов различной родовой и видовой принадлежности. Проведенные исследования показали, что высокие защитные свойства указанных сред в основном обусловлены высокой антиокислительной активностью входящих в них веществ. Например, 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин (Пат. №2045573) имеет антиокислительную активность 3.06, 7,7-диметил-2-фенил-4-(4-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин (Пат. №2088657) - 2.41. Наиболее близким к предлагаемому решению является изобретение по Пат. №2041942.

Недостатком указанных выше компонентов является неудобство методики их получения, в частности нагревание в запаянной ампуле при синтезе 7,7-диметил-2-фенил-4-(4-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина и 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолина.

Задачей настоящего изобретения является использование в качестве консерванта вещества с высокой антиокислительной активностью, расширение круга антиоксидантных компонентов для средств защиты бактерий, упрощение и удешевление методики их получения.

Техническим результатом является увеличение продолжительности хранения культур при сохранении жизнеспособности.

Поставленная задача решается тем, что в качестве консерванта для хранения бактерий используют 5-метил-3-фенил-2,4-диэтоксикарбонил-N-(4-метилфенил)-циклогекса-1,5-диениламин (диенамин).

Не известны факты пригодности диенамина как компонента защитной среды. По сравнению с известными компонентами для средств защиты микроорганизмов (7,7-диметил-2-фенил-4-(4-метоксифенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин, 2,4-дифенил-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин) предложенное соединение может быть получено по более простой методике и содержит структурные фрагменты, предопределяющие высокие антиоксидантные свойства, в частности N-ариленаминный и дигидробензольный фрагменты, гидроксильную группу. Так, антиокислительная активность диенамина, измеренная хемилюминесцентным методом, составляет 2.14 (в аналогах 2.41 и 3.06), что позволяет предложить это соединение в качестве компонента для средств защиты бактерий.

На основе диенамина может быть получен состав для хранения бактерий, содержащий водный раствор защитной белковой среды, криопротектор и раствор диенамина, мас.%:

Защитная белковая среда	0,1÷3,0
Диенамин	0,001÷0,1
Растворитель диенамина	0.1÷10
Вода	остальное.

В качестве защитной белковой среды могут быть использованы желатин и агар-агар. В качестве стабилизатора состава может быть добавлена сахароза в количестве 1÷10 мас.%.

В качестве растворителя диенамина может быть использован диметилсульфоксид (ДМСО) или этанол. Состав для хранения бактерий может иметь следующее соотношение компонентов, мас.%:

Сахароза	1÷10;
Защитные белковые компоненты:
желатин	0,5÷3;
агар-агар	0,01÷0,1;
Диенамин	0,001÷0,1;
Растворитель диенамина	0,1÷10;
Вода	остальное.

В научной, патентной литературе отсутствуют данные о подобных составах для хранения бактерий. Не известны факты пригодности диенамина как консерванта (компонента криопротекторной среды). Это не только неочевидное, более того неожиданное свойство данного соединения. Увеличение срока хранения бактерий до 2,4÷18,2 лет обусловило положительный эффект изобретения.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения.

Состав для хранения бактерий приготавливают следующим образом (расчет на 1 л воды): 0,1÷1 г агара-агара замачивают в 0,7 л дистиллированной воды, ставят на огонь, при постоянном помешивании добавляют предварительно замоченный разбухший желатин (7÷50 г). После растворения желатина добавляют сахарозу (10÷100 г), доводят до кипения. Снимают с огня и доводят объем до 1 л дистиллированной водой, фильтруют, разливают в посуду и стерилизуют при 110°С 30 мин. Затем в полученную смесь вводят диенамин, растворенный в одном из указанных растворителей (диметилсульфооксиде - ДМСО, этаноле).

5-Метил-3-фенил-2,4-диэтоксикарбонил-N(4-метилфенил)-циклогекса-1,5-диениламин получен путем ариламинирования 5-гидрокси-5-метил-3-фенил-2,4-диэтоксикарбонилциклогексанона под действием п-толуидина (выход продукта составляет 88%) [Ариламинирование 2,4-диацетил(диэтоксикарбонил)-5-гидрокси-5-метил-3-фенил(2-фурил)-циклогексанонов / В.В.Сорокин, М.В.Кузьмин, Н.С.Смирнова, Н.И.Кожевникова, А.П.Кривенько // ЖОрХ. 1994. Т.30. Вып.4. С.528-530.].

К достоинствам метода получения заявленного соединения (консерванта) следует отнести: использование для синтеза доступного и дешевого исходного сырья (продуктов основного органического синтеза), простоту аппаратурного оформления, высокий выход целевого продукта, что может иметь значение для получения веществ в больших количествах.

Строение полученного диенамина было подтверждено данными элементного анализа и ИК-спектроскопии. Образец соединения, используемого в данных исследованиях, был идентифицирован по температуре плавления пробы смешения с образцом, полученным впервые нами ранее. [Ариламинирование 2,4-диацетил (диэтоксикарбонил)-5-гидрокси-5-метил-3-фенил(2-фурил)-циклогексанонов / В.В.Сорокин, М.В.Кузьмин, Н.С.Смирнова, Н.И.Кожевникова, А.П.Кривенько // ЖОрХ. 1994. Т.30. Вып.4. С.528-530.].

Пример 1. Изучение влияния защитной среды с диенамином с применением в качестве растворителя ДМСО проводили на модели представителя семейства Enterobacterlaceae, которые широко распространены в природе и наиболее часто используются в научных исследованиях микробиологического, генетического, иммунологического и биохимического плана - вакцинном штамме чумного микроба EV НИИЭГ.

Штамм выращивали при оптимальном температурном режиме на скошенном агаре Хоттингера до стационарной фазы роста и суспендировали в варьируемой по составу среде, состоящей из сахарозы (1÷10%), желатина (0,5÷3,0%) и агара-агара (0,01÷0,1%) с добавлением 0,001÷0,1% диенамина, растворенного в 0,1% ДМСО. Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов в серии опытов установлено, что диенамин в концентрациях 0,01÷0,05% увеличивает продолжительность штамма в лиофилизированном состоянии с сохранением жизнеспособных клеток с 1,8 лет (в контроле) до 2,4÷5,6 лет в зависимости от концентрации диенамина, т.е. в 1,3÷3,1 раза.

Пример 2. В составе, описанном в примере 1, хранили тот же штамм при аналогичных условиях, но с измененной концентрацией ДМСО - 10%. Срок хранения в серии опытов увеличивался с 1,8 до 3,0÷6,9 лет (в 1,7÷3,8 раза) при сохранении жизнеспособности.

Пример 3. В составе, описанном в примере 1, хранили тот же штамм при использовании в качестве растворителя диенамина 0,1% этанола. Срок хранения в серии опытов увеличивался с 1,8 до 3,3÷8,2 лет (в 1,8÷4,6 раза) при сохранении жизнеспособности.

Пример 4. В составе, описанном в примере 1, хранили штамм кишечной палочки С-600 - представителе семейства Enterobacterlaceae. Срок хранения увеличивался с 3,5 до 18,2 лет (в 5,2 раза).

Вывод: из приведенных в примерах данных следует, что оптимальный результат получается при использовании диенамина в концентрации 0,001÷0,01%, растворенного в 1÷10% ДМСО (срок хранения увеличивается в 1,3÷4,6 раза). Применение этанола в качестве растворителя, являющегося одновременно антиоксидантом, позволило получить увеличение срока хранения по сравнению с контрольным образцом при сохранении жизнеспособности в 5,2 раза.

На следующем этапе была использована дополнительная защитная белковая среда.

Пример 5. Изучение влияния защитной среды с диенамином с применением в качестве дополнительного компонента защитной белковой среды нормальной лошадиной сыворотки проводили на представителе семейства Enterobacteriaceae - вакцинном штамме чумного микроба EV НИИЭГ.

Штамм выращивали на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2 в оптимальном температурном режиме до стационарной фазы роста и суспендировали в среде, состоящей из нормальной лошадиной сыворотки и бульона Хоттингера рН 7,2 (3:1) в соотношении 1,7÷18 мас.% к общему составу с добавлением диенамина 0,001÷0.1%, растворенного в 0,1% ДМСО.

В результате проведенных экспериментов установлено, что защитная белковая среда с применением лошадиной сыворотки и бульона Хоттингера с диенамином в указанной выше концентрации увеличивает продолжительность хранения штамма в лиофилизированном состоянии с сохранением 50% выживших клеток с 3,2 лет (в контроле) до 8,1 года, т.е. в 2,5 раза.

Пример 6. Изучение влияния защитной среды с диенамином на продолжительность хранения широко распространенных в природе спорообразующих микроорганизмов семейства Bacillaceae в лиофилизированном состоянии проведено на вакцинном штамме возбудителя сибирской язвы - «СТИ».

Штамм выращивали на агаре Хоттингера рН 7,2 при температуре 37°С до стационарной фазы роста (18-24 ч). Суспензию готовили в среде, состоящей из 10% сахарозы, 1,5% желатина, 0,1% агар-агара с добавлением 0,001÷0,1% диенамина, растворенного в 0,1% ДМСО. Полученную смесь разливали по ампулам и лиофилизировали. В результате проведенных экспериментов установлено, что диенамин в концентрации 0,01% увеличивает продолжительность хранения штамма возбудителя сибирской язвы в лиофилизированном состоянии с сохранением жизнеспособных клеток с 6,5 лет (в контроле) до 17,8 лет, т.е. в 2,7 раза.

Приведенные примеры подтверждают свойство диенамина как консерванта для хранения бактерий различного родового и видового состава при использовании в качестве растворителя ДМСО и этанола, при этом сроки хранения увеличиваются до 1,3÷5,2 раза при сохранении 50% жизнеспособности тестируемых объектов.

Таблица
Результаты применения диенамина в составе защитной среды для консервации бактерий методом лиофилизации на модели вакцинного штамма чумного микроба EV НИИЭГ
Концентрация диенамина %	Растворитель	Продолжительность хранения культуры (годы)
0,010	0,1%ДМСО	2,4
0,025	- -	5,0
0,050	- -	5,2
0,010	- -	5,6
0,025	- -	2,3
0,0010	10%ДМСО	6,9
0,0025	- -	5,7
0,0050	- -	3,0
0,010	- -	3,0
0,025	- -	3,0
0,0025	0,1% спирт-этанол	5,7
0,0050	химически чистый	8,2
0.010	- -	7,0
0,025	- -	3,3

Примечание. Контрольные образцы содержат 10% сахарозы, 1,5% желатины, 0,1% агар-агара, срок хранения в данной среде 1,8 года. Опытные - то же, с добавлением диенамина в соответствующем растворителе.