биотрансплантат и способ лечения хронической сердечной недостаточности (варианты)

Формула изобретения

1. Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), МСК выращивают в виде прикрепленных колоний на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фиобластов - 2 и 8U/мл гепарина, при этом отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов, а выращивание колоний ведут из плотности 10-50 клеток на см².

2. Биотрансплантат по п.1, где в качестве фетального материала используют ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель.

3. Биотрансплантат по п.1, где в качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации.

4. Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что он содержит миобласты, полученные из скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности, и включает не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1) или из мышечной ткани взрослого человека любой локализации.

5. Способ получения биотрансплантата для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что ткань скелетных мышц отмывают, измельчают, далее дезагрегируют в растворе, содержащем раствор коллагеназы II типа и трипсина в течение 40-90 мин, полученную суспензию диссоциированных клеток культивируют на среде, содержащую ростовую среду ДМЕМ/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит) и 5 нг/мл фактора роста эпидермиса до достижения конфлюэнтного монослоя, затем осуществляют пассирование, дезагрегацию монослоя раствором трипсина, при этом процесс культивирования ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% СО₂ .

6. Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что он содержит клетки предшественники эндотелия, представляющие собой спефицическую субпопуляцию прогениторных клеток, обеспечивающих формирование кровяных сосудов при эмбриональном органогенезе и регенерации органов в постнатальном периоде, при этом ранние ЕРС характеризуются иммунофенотипом AC133+/CD34+/KDR+/CD117+/VE-cad-/Tie2+ и в процессе дифференцировки до зрелых эндотелиоцитов изменяют профиль экспрессии на AC133-/CD34+/KDR+/VE-cad+/vWf+.

7. Биотрансплантат по п.6, где источником клеток предшественников эндотелия являются фетальные и внезародышевые ткани на всех этапах развития плода (пуповинная кровь, плацента, печень плода, мышца) или биоптаты костного мозга, подкожной и висцеральной жировой ткани и периферическая кровь взрослых доноров.

8. Способ лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что биотрансплантат по п.1, и/или 4, и/или 6 вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аортокоронарный шунт соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.

9. Способ по п.8, где биотрансплантат вводят с объемной скоростью, которая предотвращает вымывание клеток в аортальной кровоток.

10. Способ по п.8, мезенхимальные стволовые клетки, миобласты, предшественники эндотелия вводят как в моноварианте, так и в комбинации, в физиологическом растворе, или инфуколе, или другой среде для трансплантации.

11. Способ по п.8, где интрамиокардиальное введение клеточного биотрансплантата проводят во время традиционных хирургических вмешательствах на открытом сердце.

12. Способ по п.11, где клеточный биотрансплантат вводят на заключительном этапе операции путем множественных инъекций (30-50) инсулиновым шприцем по 0,1-0,2 мл клеточной суспензии, при этом при диффузных формах поражения миокарда клеточный трансплантат равномерно распределяют по стенке левого желудочка, при очаговом поражении миокарда в область ишемизированного, но жизнеспособного миокарда.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области приготовления генетически немодифицированной культуры мезенхимальных стволовых клеток человека, фетальных миобластов и способа лечения хронической сердечной недостаточности.

Успехи кардиологов, хирургов и специалистов в области интервенционных методов лечения привели к уменьшению доли острых нарушений кровообращения, таких как инфаркт миокарда и инсульт, в структуре смертности населения в развитых странах. В 21 веке на лидирующую позицию в этом важном демографическом показателе вышла сердечная недостаточность (СН). В России в настоящее время сердечную недостаточность имеют более 8 млн. пациентов, у 10% из которых она является осложнением дилатационной кардиомиопатии.

В основе всех современных методов лечения патологии сердца лежит восстановление кровоснабжения сердца, хирургическое ремоделирование его полостей. У пациентов с критическим снижением массы жизнеспособного миокарда вследствие диффузного некроза и/или апоптоза ни хирургические, ни тем более терапевтические мероприятия неэффективны, поскольку регенерационные свойства сердца весьма ограничены. Кардиомиоциты не обладают значимой пролиферативной активностью, при повреждении миокарда преобладают фибропластические реакции стромы, которые необратимы. Поэтому имеется необходимость в разработке принципиально новых подходов к лечению пациентов с СН. В подобных случаях альтернативным методом лечения может стать применение методов клеточной трансплантации с целью стимуляции неоангиогенеза, создания новых сократительных элементов путем имплантации в миокард стволовых/прогениторных клеток для улучшения перфузии, восстановления функции и/или стимуляция регенерации собственных кардиомиоцитов.

В экспериментальных исследованиях последних лет было показано, что трансплантация клеток различного фенотипа (эмбриональные кардиомиоциты, миобласты, взрослые предифференцированные стромальные клетки костного мозга и др.) положительно влияют на сократительную функцию миокарда. При этом было показано, что привнесенные в миокард клетки длительно переживают, пролиферируют и дифференцируются в миокарде после трансплантации, выделяют различные биоактивные вещества: ростовые факторы, цитокины и др. Основные эффекты от имплантации клеток выражаются в индукции репаративных процессов в месте повреждения, ограничении роста зоны инфаркта миокарда, улучшении механических свойств рубцово-измененной мышцы сердца, улучшении васкуляризации миокарда путем стимуляции неоангиогенеза, при этом достоверно улучшается перфузия миокарда. В последние годы исследователи стали придавать особое значение такому источнику стволовых и прогениторных клеток, как костный мозг. Экспериментальные исследования подтвердили эффективность применения клеток костного мозга в восстановлении функции пораженного миокарда.

Экспериментальные исследования послужили основанием для развития клеточной кардиомиопластики в клинической медицине. С 2001 г начались ограниченные клинические исследования по интракоронарному и интрамиокардиальному введению различных клеточных популяций как за рубежом (Humano et al. 2001, Strauer et al. 2002, Assmuss et al. 2002, Wolert et al. 2003, Brehm et al. 2003, Schachinger et al. 2004, Kuethe, 2005 и др.), так и в России (В.И.Шумаков и соавт., 2003, Л.А.Бокерия и соавт., 2004). Во всех работах продемонстрирована клиническая эффективность и безопасность этих методов лечения.

В настоящее время существует два основных способа трансплантации клеточного материала в сердце: интрамиокардиальный и интракоронарный. При интрамиокардиальном введении часть клеток (до 45%) гибнет от ишемии, поскольку уровень васкуляризации в месте введения может оказаться недостаточным [Zhang М, Murry СЕ. Death of Grafted Cardiomyoctyes Limits Formation of New Myocardium in Injured Hearts. Circulation, 1999; 100 (suppi I):I-837].

Задачей настоящего изобретения является получение биотрансплантата для наиболее эффективного (комплексного) воздействия на миокард человека и разработка наиболее эффективного способа лечения хронической сердечной недостаточности.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

Биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала, при этом ткань дезагрегируют; далее культивируют в виде прикрепленных колоний в ростовой среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и глутамин, затем неоднократно пассируют в низкой плотности с изменением состава среды, а культивирование ведут, избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель.

В качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации и аллотрансплантации.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения хронической сердечной недостаточности, заключающийся в том, что МСК выращивают в виде прикрепленных колоний на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8U/мл гепарина, при этом отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов, а выращивание колоний ведут из плотности 10-50 клеток на см ², при этом используют МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке выделенные из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) тканей человека и МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке, выделенные из тканей пациента (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань).

Предложен биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, содержащий миобласты, полученные из скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности, и включает не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры ранеего миогенеза (Myo D-1) и из скелетных мышц взрослого человека, как донора, так и аутологичные.

Предложен также способ получения биотрансплантата для лечения хронической сердечной недостаточности, заключающийся в том, что ткань скелетных мышц человека отмывают, измельчают, далее дезагрегируют в растворе, содержащем раствор коллагеназы II типа и трипсина, в течение 40-90 минут, полученную суспензию диссоциированных клеток культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя, затем осуществляют пассирование, дезагрегацию монослоя раствором трипсина, при этом процесс культивирования ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% СО ₂.

Суспензию клеток засевают на среду, содержащую ростовую среду ДМЕМ/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит) и 5 нг/мл фактора роста эпидермиса, и клетки засевают с плотностью не менее 1×10 кл/мл.

Среду в процессе культивирования неоднократно меняют.

Предложен биотрансплантат для лечения хронической сердечной недостаточности, содержащий предшественники эндотелия (ЕРС), выделенные из фетального или донорского материала и представляющие собой спефицическую субпопуляцию прогениторных клеток, обеспечивающих формирование кровеных сосудов при эмбриональном органогенезе и регенерации органов в постнатальном периоде. Ранние ЕРС характеризуются иммунофенотипом AC133+/CD34+/KDR+/CD117+/VE-cad-/Tie2+ и в процессе дифференцировки до зрелых эндотелиоцитов изменяют профиль экспрессии на AC133-/CD34+/KDR+/VE-cad+/vWf+.

Источниками ЕРС являются фетальные и внезародышевые ткани на всех этапах развития плода (пуповинная кровь, плацента, печень плода, мышца) или биоптаты костного мозга, подкожной и висцеральной жировой ткани и периферическая кровь взрослых доноров.

Процедура изоляции ЕРС включает выделение популяции ядросодержащих клеток и последующее проведение позитивной селекции с использованием магнитных шариков, меченных антителами против специфического маркера ранних ЕРС - АС133. После изоляции клетки культивируются на чашках, покрытых фибронектином, в среде, содержащей специфический набор ростовых факторов (фактор роста эндотелия - VEGF, основной фактор роста фибробластов - bFGF, инсулиноподобный фактор роста 1 типа - IGF-1). В течение периода культивирования производится цитофлюориметрический контроль иммунофенотипа клеточных популяций.

Способ лечения хронической сердечной недостаточности заключается в том, что ранее указанные биотрансплантаты вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аортокоронарный шунт соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента.

Трансплантацию осуществляют в стационаре, в условиях стерильной рентгеноперационной путем введения гомогенной взвеси клеток в "заинтересованные" нативные коронарные артерии и/или аортокоронарные шунты. Клеточный биотрансплантат перемешивают с 40 мл физиологического раствора. В процессе выполнения процедуры необходимо постоянное перемешивание суспензии для поддержания клеток во взвешенном состоянии. Доступ к коронарным артериям и/или аортокоронарным шунтам осуществляется по стандартной методике через бедренную или подкрыльцовую артерию с использованием катетеров Judkins и Sones. После выполнения коронаро- и/или шунтографии по стандартной методике оценивается объем миокарда левого желудочка, кровоснабжаемого каждым из коронарных сосудов и/или аортокоронарных шунтов. Распределение общего количества клеток для введения в каждый из коронарных сосудов и/или аортокоронарных шунтов производится прямо пропорционально этому объему. Введение клеток осуществляют стерильным 50 мл шприцом с помощью инфузомата с объемной скоростью 100 мл/час.

Введение клеточного трансплантата осуществляется в 2 этапа:

1. Первый этап - установка катетера в устье коронарной артерии.

2. Второй этап - собственно введение клеточной взвеси с помощью инфузомата с объемной скоростью 100 мл/час.

Окончание процедуры не отличается от таковой при рутинной коронарографии.

В течение 24 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом витальных функций и анализом нарушений ритма сердца.

Способ лечения хронической сердечной недостаточности, характеризующийся тем, что интрамиокардиальное введение клеточного трансплантата при различных сердечно-сосудистых заболеваниях, сопровождающихся сердечной недостаточностью, показано во время традиционных хирургических вмешательствах на открытом сердце. Клеточный биотрансплантат вводят на заключительном этапе операции путем множественных инъекций (30-50) инсулиновым шприцем по 0,1-0,2 мл клеточной суспензии. При диффузных формах поражения миокарда клеточный трансплантат равномерно распределяют по стенке левого желудочка. При очаговом поражении миокарда область введения определяют на основании данных коронарографии, ЭхоКГ, сцинтиграфии как область ишемизированного, но жизнеспособного миокарда. Окончание операции не отличается от таковой при стандартном вмешательстве на открытом сердце. Процедура ведения трансплантата должна сопровождаться обязательным мониторированием электрокардиограммы.

Окончание процедуры не отличается от такового после рутинной коронарографии.

В течение 16 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления. Выписка на 7-е сутки с рекомендацией контрольного осмотра через 1 месяц.

Проведение клеточной терапии при различных сердечно-сосудистых заболеваниях целесообразно применять как в моноварианте, так и в сочетании с традиционными хирургическими методами лечения, такими как чрескожная транслюменальная баллонная ангиопластика, аортокоронарное шунтирование, вентрикулопластика, протезирование клапанов, имплантации экстракардиального каркаса и др.

Эффективность предложенного способа оценена в рандоминизированном исследовании. Диагноз у всех пациентов устанавливался на момент операции и формулировался как хроническая сердечная недостаточность 2б функционального класса (3-4 класса по NYHA). В период провидения исследования все пациенты получали стабильную медикаментозную терапию средними терапевтическими дозами ингибиторов АПФ, -адреноблокаторами, диуретиками.

На протяжении всего исследования пациенты не получали иммуносупрессивной терапии.

В контрольную группу включены пациенты с аналогичным диагнозом, с хронической сердечной недостаточностью 2б функционального класса, получающие соответствующую стабильную медикаментозную терапию.

Всем пациентам проводили динамическое обследование пациентов: общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови, ЭКГ, ЭхоКГ, ангиокардиография, в том числе по методике Centrline.

Имплантацию осуществляли в условиях стерильной рентгеноперационной путем введения суспензии аллогенных скелетных миобластов 10 млн. кл./кг массы тела в 100 мл физиологического раствора в аортокоронарные шунты. Доступ к коронарным артериям и аортокоронарным шунтам осуществляли по стандартной методике через бедренную артерию. В течение 16 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления.

В раннем послеоперационном периоде ни у одного из пациентов не наблюдалось каких-либо реакций, побочных эффектов или осложнений, связанных с процедурой.

Через 1-3 месяца после имплантации все пациенты отмечали улучшение самочувствия, объективно наблюдалось улучшение общего состояния, повышение толерантности к физическим нагрузкам, уменьшение одышки, периферических отеков, гепатомегалии, при инструментальном обследовании выявлено незначительное уменьшение объемов сердца, размеров зон гипокинетичного миокарда, увеличение ФВ ЛЖ. В контрольной группе, в условиях стабильной медикаментозной терапии, состояние и клинико-лабораторные показатели пациентов не изменились или отмечалась отрицательная динамика.

Больной Т., 54 лет, поступил в Самарский областной клинический кардиологический диспансер с жалобами на выраженную общую и мышечную слабость, быструю утомляемость, одышку при незначительной физической нагрузке, иногда - в состоянии покоя, отеки на нижних конечностях, доходящие до уровня верхней трети голеней, чувство дискомфорта в области правого подреберья.

Из анамнеза известно - перенес два инфаркта миокарда (в 1996 и 1997 годах). В 1998 году пациенту проведена операция аортокоронарное шунтирование и вентрикулопластика по Дору. После операции чувствовал себя несколько лучше в течение полутора лет, после чего вновь вернулась одышка при незначительной физической нагрузке, а зачастую и в покое.

При объективном исследовании отмечен цианоз кожи и видимых слизистых оболочек, похолодание кожи конечностей. Аускультативно в легких - на фоне жесткого дыхания в нижних отделах выслушиваются влажные мелкопузырчатые хрипы. Тоны сердца глухие, ритм правильный. ЧСС 84 в 1 мин. Печень выступает из-под края реберной дуги на 4 см, болезненна при пальпации, гладкая, край ее закруглен.

Общий анализ крови: гемоглобин - 130 г/л, эритроциты - 4,2*10^12 в 1 л, лейкоциты - 6,8*10^9 в 1 л, СОЭ - 18 мм/ч.

Биохимические показатели: билирубин общий - 29 мкмоль/л, белок общий - 70 г/л, мочевина 7,3 ммоль/л, креатинин - 149 мкмоль/л, коэффициент атерогенности 4,9.

ЭКГ: ритм синусовый, вертикальное положение ЭОС, гипертрофия ЛЖ с изменениями комплекса QRS, гипертрофия ПЖ.

ЭхоКГ: Регургитация на митральном клапане 1 ст. Диаметр основания аорты 32 мм. Регургитации на аортальном клапане нет. Градиент между ЛЖ и аортой 11 мм рт. ст. Регургитация на трехстворчатом клапане 1 ст. Систолический градиент на трехстворчатом клапане 47 мм рт. ст. Диаметр легочной артерии 29 мм. Давление в легочной артерии 41 мм рт. ст. Недостаточности клапана легочной артерии нет. Передне-задний размер ЛП 47 мм. Медиально-латеральный размер ЛП 48 мм. Верхне-нижний размер ЛП 60 мм. КДРЛЖ 74 мм, КСРЛЖ 61 мм, КДОЛЖ 164 мл, КСОЛЖ 94 мл, ФВ 32% (по Симпсону 25%). Толщина МЖП 8/9 мм. Толщина задней стенки ЛЖ 11/17 мм. Гипокинезия апикально-латерального сегмента, апикального сегмента предсердной стенки. Акинезия верхушки, апикально-септального сегмента.

Ангиокардиография: КДО 317 мл, КСО 207 мл, УО 57 мл, ФВ 27%. При исследовании по методике Centraline 50% сегментов миокарда асинергичны с явлениями гипо- и акинезии, а уровень сократимости остальных 50% миокарда находился на нижней границе нормы.

Поставлен диагноз: ИБС. Ишемическая кардиомиопатия. Постинфарктный кардиосклероз (1996, 1997). Состояние после аортокоронарного шунтирования и резекции ЛЖ (1998). Гипертоническая болезнь 3 стадии. Хроническая сердечная недостаточность 26 функционального класса (3-4 класса по NYHA).

10 ноября 2003 года больному проведена операция коронаровентрикулография с интракоронарным введением клеточного биотрансплантата (1 млрд. МСК в 20 мл физиологического раствора).

В течение 16 часов после операции пациент наблюдался в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления. Послеоперационное течение гладкое. Больной выписан на 2-е сутки.

При контрольном осмотре через 7 месяцев пациент отмечает значительное улучшение состояния, уменьшение слабости, утомляемости. Одышка возникает только при физической нагрузке. Без остановки поднимается на 3-4 этаж. Отеков нет, отмечает пастозность стоп к вечеру. Сохраняется дискомфорт в правом подреберье.

При осмотре кожа и видимые слизистые обычной окраски. Аускультативно в легких дыхание жесткое, хрипов нет. Тоны сердца глухие, ритм правильный. ЧСС 76 в 1 мин. печень выступает из-под края реберной дуги на 1 см.

Лабораторные показатели крови без существенной динамики.

ЭхоКГ: Регургитация на митральном клапане 1 ст. Диаметр основания аорты 32 мм. Регургитации на аортальном клапане нет. Регургитация на трехстворчатом клапане 1 ст. Систолический градиент на трехстворчатом клапане 36 мм рт. ст. Диаметр легочной артерии 27 мм. Давление в легочной артерии 38 мм рт. ст. Недостаточности клапана легочной артерии нет. Передне-задний размер ЛП 40 мм. Медиально-латеральный размер ЛП 52 мм. Верхне-нижний размер ЛП 52 мм. КДРЛЖ 66 мм, КСРЛЖ 49 мм. ФВ 49% (по Симпсону 42%). Толщина МЖП 9/13 мм. Толщина задней стенки ЛЖ 9/17 мм. Гипокинезия верхушки, септально-апикального сегмента, апикального сегмента МЖП, передней стенки, латерально-апикального сегмента.

Ангиокардиография - КДО - 189 мл, КСО - 138 мл. УО - 110 мл, ФВ 37%. При исследовании по методике Centraline 30% сегментов миокарда асинергичны с явлениями гипокинезии, уровень сократимости 25% миокарда на нижней границе нормы, а сократимость 45% сегментов миокарда была нормальной.

По результатам обследования данного пациента через 7 месяцев после операции улучшились общее состояние и клинико-лабораторные показатели. По ЭхоКГ ФВ возросла на 12%, КДОЛЖ уменьшился на 2,8%, при проведении ангиокардиографии в динамики значимо уменьшился размер зоны гипокинетичного миокарда.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии каких-либо побочных эффектах и осложнений в ранний и поздний послеоперационный период при интракоронарном введении клеточного биотрансплантата без проведения иммуносупрессии. Кроме того, получены предварительные данные об эффективности клеточной кардиомиопластики при хронической сердечной недостаточности.