способ определения продуктов цитохимической реакции, протекающей в нейтрофилах и эозинофилах мокроты под воздействием миелопероксидазы

Формула изобретения

Способ определения продуктов цитохимической реакции, протекающей в нейтрофилах и эозинофилах мокроты под воздействием миелопероксидазы, включающий исследование клеток в мазках биологического образца, которые фиксируют формалино-спиртовым раствором, обмывают в проточной воде, высушивают, заливают реактивом на пероксидазу, содержащим бензидин, 96% этиловый спирт, воду, перекись водорода, докрашивают красителем, промывают в проточной воде и высушивают, отличающийся тем, что исследуют свежеприготовленные мазки мокроты, не более однодневной давности, окрашивание производят в течение 20 мин, промывают дистиллированной водой в течение 10 с и докрашивают красителем азур-1 в течение 5-15 с.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, к средствам для диагностики и может быть использовано для определения продуктов цитохимической реакции, протекающей в нейтрофилах и эозинофилах индуцированной мокроты под воздействием миелопероксидазы (МПО).

Наиболее близким к предлагаемому является способ, предложенный K.Paul, E.Rietschel et al., заключающийся в количественном определении активности МПО у больных муковисцидозом (Amer. Jour. of Resp. and Crit Care, vol. 169, 2004), путем спектрофотокалорометрии образцов жидкостей бронхоальвеолярного лаважа. Реакция отслеживается по длине волны 470 нм, на аппарате Arospec III, Germany. Активность МПО определяется как соответствие 1 единицы активности МПО расходу 1 ммоль перекиси водорода. Однако известный способ недостаточно точен и информативен, так как не позволяет количественно оценить активность МПО в (отдельно взятой) определенной клетке, за счет чего снижается точность диагностики бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких, при которых нейтрофилы и эозинофилы являются основным клеточным субстратом воспаления.

Новая техническая задача - повышение точности и информативности способа.

Поставленную задачу решают новым способом определения продуктов цитохимической реакции, протекающей в нейтрофилах и эозинофилах под воздействием миелопероксидазы, заключающимся в исследовании образцов мокроты, причем исследуют свежеприготовленные мазки индуцированной мокроты не более однодневной давности, которые фиксируют в 4% спиртово-формалиновой смеси в течение 30 секунд, промывают в проточной воде, высушивают, после чего помещают на рельсы и заливают реактивом, состоящим из 10 частей бензидина, 60 мл 96% этилового спирта, 40 мл дистиллированной воды, 0,2 мл 3% раствора перекиси водорода и выдерживают в течение 20 минут, затем промывают дистиллированной водой в течение 10 секунд, промокают фильтровальной бумагой, докрашивают красителем азур-1 в течение 5-15 секунд и промывают в проточной воде.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Свежеприготовленные мазки не более однодневной давности фиксируют в спиртово-формалиновой смеси в течение 30 секунд.

2. Промывают в проточной воде, высушивают.

3. Стекла с мазками мокроты помещают на рельсы и заливают реактивом на миелопероксидазу (10 частей бензидина, 60 мл 96% этилового спирта, 40 мл дистиллированной воды, 0,2 мл 3% раствора перекиси водорода) на 20 минут.

4. Стекла с мазками мокроты промывают дистиллированной водой в течение 10 секунд и промокают фильтровальной бумагой.

5. Мазки докрашивают красителем азур-1 в течение 10-15 секунд.

6. Стекла промывают в проточной воде.

Предлагаемый способ был предложен в результате анализа результатов экспериментов с препаратами индуцированной мокроты, при которых проводилось варьирование времени контакта клеток мазка индуцированной мокроты с реактивом на миелопероксидазу, а также использованием препаратов с различным сроком давности приготовления. При времени контакта клеток мазка индуцированной мокроты с реактивом на миелопероксидазу менее 20 минут и/или при наличии мазка, приготовленного более суток назад, продукты цитохимической реакции в клетках не выявлялись, либо выявлялись с меньшей степенью интенсивности окрашивания (Фиг 1).

При увеличении времени контакта клеток мазка индуцированной мокроты с реактивом на миелопероксидазу и/или при наличии свежего мазка, сроком давности менее суток, продукты реакции окрашивались очень интенсивно, что затрудняло процесс идентификации клеток (Фиг.2).

Проведено исследование образцов мокроты 50 пациентов с хронической обструктивной болезнью легких. Продукты реакции обнаруживались в 38-89% нейтрофилов и в 100% эозинофилов индуцированной мокроты больных хронической обструктивной болезнью легких. Данная методика апробирована на кафедре госпитальной терапии ГОУ ВПО "Сибирский государственный медицинский университет".

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью провести определение продуктов цитохимической реакции, протекающей в нейтрофилах и эозинофилах индуцированной мокроты под воздействием миелопероксидазы, что важно для постановки точного диагноза и назначения, в соответствии с этим, более адекватных лечебно-профилактических мероприятий.