способ оценки антибактериальных свойств пектинов

Формула изобретения

Способ определения антибактериальных свойств пектинов путем их количественной оценки, отличающийся тем, что хемилюминесцентным методом определяют антиокислительную активность (АОА) пектинов и по величине АОА судят об антибактериальных свойствах пектинов, причем с увеличением АОА увеличивается их бактерицидная активность.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в микробиологической и клинической практике для оценки антибактериальных свойств пектинов.

Пектины представляют собой водорастворимые полисахариды растительного происхождения, которые используются для профилактики и лечения различных заболеваний. Пектины обладают антибактериальным действием в отношении многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, способствуют нормализации микрофлоры кишечника при дисбактериозах, оказывают положительное влияние на основные показатели иммунного статуса больных, улучшая состояние гуморального и клеточного звеньев иммунитета, проявляют антиокислительные свойства [см. Потиевский Э.Г., Дроздов В.Н. Антибактериальное действие пектина в эксперименте и клинике - Омск, 1997. - 96 с.; Лазарева Е.Б., Меньшиков Д.Д. Опыт и перспективы использования пектинов в лечебной практике Ж. Антибиотики и химиотер. 1999. - Т.44. - N.2. - С.37-40; Чаяло П.П., Береза В.Я., Яцула Г.С. и соавт. Влияние пектина и пектиносодержаших продуктов на некоторые метаболические показатели крови и ткани печени крыс, подвергшихся внешнему -облучению Ж. Радиационная биохимия, 1992. - T.32. - N2. - C.211-217]. Это позволяет использовать пектины в комплексной антибактериальной терапии гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений.

Известно что антибактериальные свойства пектинов обычно оценивают по скорости гибели микроорганизмов в растворах пектинов, используя высев на плотные питательные среды количественным методом в модификации Gould J.C. [Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология/Пер. с англ. - М.: Мир, 1967. - 347 с.; Gould J.C. "Quantity and quality in the diagnosis of urinary tract infection" Brit.J Urol. 1965. - V.37. - N1. - P.]. Однако этот метод трудоемкий, требует многочисленных пересевов на плотные питательные среды, что связано с существенными материальными затратами и занимает много времени (до 3 суток).

Помимо антибактериальных свойств пектины проявляют in vivo антиокислительные свойства. Известно что антиокислительная активность (АОА) плазмы или сыворотки крови, которая отражает ее способность тормозить свободнорадикальное окисление как в каких-либо субстратов, так и фармакологических препаратов, является важным интегральным показателем состояния антиоксидантной системы человека [Halli-well B., Gutteridge J.M.C./Free Radio. Biol. Med. 1995. - N18. - P.125-126]. Для оценки антиокислительных свойств пектинов in vivo используются отдельные показатели перекисного окисления липидов (гидроперекиси липидов, малоновый диальдегид и др.) [Чаяло П.П., Береза В.Я., Яцула Г.С. и соавт. Влияние пектина и пектиносодержащих продуктов на некоторые метаболические показатели крови и ткани печени крыс, подвергшихся внешнему -облучению Ж. Радиационная биохимия, 1992. - T.32. - N2. - C.211-217].

В доступной литературе не обнаружено данных об использовании хемилюминисцентного метода для определения антибактериальных свойств пектинов. В результате многочисленных исследований установлено, что при увеличении ДОА пектинов уменьшалось количество колониеобразующих единиц (жизнеспособных бактериальных клеток). То есть с увеличением величины ADA четко увеличивались бактерицидные свойства данного пектина. На основе этой зависимости предлагается быстрый способ определения антибактериальных свойств пектинов по данным количественного определения АОА.

Сущность его заключается в следующем.

Хемилюминисцентным методом определяют АОА пектинов и по ее величине - большей или меньшей - оценивают соответственно (большие или меньшие) антибактериальные свойства пектинов, то есть с увеличением АОА увеличивается их бактерицидная активность.

Определение АОА пектинов хемилюминисцентным методом является фактически экспресс-методом (30 минут) оценки антибактериальных свойств пектинов.

В частности, был проведен сравнительный анализ определения антибактериальных свойств пектинов культуральным бактериологическим методом с параллельным изучением их АОА. В таблице представлены данные о времени потери жизнеспособности микроорганизмов в исследованных растворах пектинов. Выявлено, что яблочный и свекловичный пектин обладают выраженным бактерицидным действием в отношении многих микроорганизмов. Однако свекловичный пектин по сравнению с яблочным оказывает более активное бактерицидное действие, это проявляется потерей жизнеспособности в более ранние сроки таких микроорганизмов как: Shigella sonnei, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Streptococcus viridans и Enterococcus faecal is. И очень слабо выраженным бактрицидным действием обладает цитрусовый пектин.

Метод осуществляется следующим образом.

Хемилюминисцентная система Hb-Н ₂О₂-люминол регистрируется при 37°С и постоянном перемешивании на хемилюминометре типа ХЛМ-3 ("Бикап", Москва). Для инициирования свободнорадикального окисления люминола в реакционную среду общим объемом 5 мл, содержащую 0,21 мкМ Hb и 10 мк M люминола в фосфатном буфере (50 мкМ КН ₂PO₄; 100 мкМ ЭДТА, рН-7,4) добавляется 20 мкМ Н₂О₂ и далее регистрируется кинетика хемилюминисценции. В качестве измеряемого параметра используется латентный период (T₀ ), который определяется как время от момента инициирования свободнорадикального окисления люминола до начала появления свечения (чертеж). Добавление к системе Hb-H₂О₂ -люминол 20 мкл 1% раствора пектина (свекловичного, яблочного или цитрусового), приготовленного на физиологическом растворе или 10 мкл стандартного раствора аскорбата (10 мМ), приготовленного на фосфатном буфере в день эксперимента, вызывает увеличение латентного периода (от Т₀ до Т) (чертеж). АОА пектина представляется в виде концентрации (С) эквивалентного раствора аскорбата, то есть С аскорбата, при которой латентный период увеличивается на ту же величину, что и при внесении в систему раствора пектина. Для этого в модельную систему вносится 10 мкл раствора пектина, измеряется латентый период и с помощью эмпирического уровня Т/Т₀=2,75 С+1,23 для аскорбата находится соответственное значение С. Далее, умножив С на разведение пектина, вычисляем его АОА в мМ аскорбата (аскорбатный эквивалент). Получение результатов через 30 минут с момента начала определения.

Измеренная АОА, исследованных in vitro пектинов, свидетельствует, что в наибольшей степени антиоксидантными свойствами обладают свекловичный пектин (АОА=1,65 мМ аскорбата), далее яблочный (АОА=1,13 мМ аскорбата) и очень слабая антиокислительная активность у цитрусового пектина (АОА=0,01 мМ).

Проведено изучение антибактериальных свойств лишь трех из множества пектинов. В клинической практике предлагаемый способ необходим не только для определения антибактериальных свойств у других видов пектинов, но и для уже изученных, ибо антибактериальные свойства могут изменяться в любую сторону в зависимости от качества сырья, изготовления, транспортировки, хранения и других факторов, а также их сочетанного применения.

Таблица.
Сроки потери жизнеспособности микроорганизмов в 1% растворах пектинов, приготовленных на физиологическом растворе и обладающих различной АОА.
Микроорганизмы	Пектины
	свекловичный (АОА=1,65 мМ аскарбата)	Яблочный (АОА=1,13 мМ аскарбата)	цитрусовый (АОА=0,01 мМ аскарбата)
Salmonella enteritidis	24 ч	24 ч	>72 ч
Shigella sonneti	4 ч	24 ч	>72 ч
Klebsiella pneumonia	48 ч	>72 ч	>72 ч
Proteus vulgaris	24 ч	>72 ч	>72 ч
Staphylococcus aureus 209-P	>72 ч	48 ч	>72 ч
Staphylococcus aureus "Жаев"	24 ч	>48 ч	>72 ч
Staphylococcus epidermidis	24 ч	24 ч	>72 ч
Pseudomonas aeruginosae	24 ч	24 ч	>72 ч
Streptococcus pyogenes	1 ч	1 ч	24 ч
Streptococcus pneumonia	1 ч	1 ч	48 ч
Streptococcus viridans	1 ч	4 ч	48 ч
Enterococcus faecalis	2 ч	24 ч	>72 ч
Escherihia coli	24 ч	24 ч	>72 ч
Bacillus subtilis	24 ч	1 ч	>72 ч