бромид 1-гексадецил-r-(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана - иммуномодулятор с противоопухолевыми, бактериостатическими и антиагрегантными свойствами и способ его получения
Классы МПК: | C07D453/02 содержащие хинуклидиновые циклические системы, не конденсированные с другими кольцами A61K31/439 кольцо, являющееся частью мостиковой кольцевой системы, например хинуклидин A61K31/14 четвертичные аммониевые соединения например эдрофониум, холин A61P37/02 иммуномодуляторы |
Автор(ы): | Аникиенко Константин Александрович (RU), Панков Дмитрий Игоревич (RU), Полезина Алевтина Сергеевна (RU), Михалева Ирина Леонидовна (RU), Киселевский Михаил Валентинович (RU), Анисимова Наталья Юрьевна (RU), Доненко Федор Витальевич (RU), Добрянский Вячеслав Станиславович (RU), Поляков Виктор Станиславович (RU), Мельников Владимир Алексеевич (RU), Петрунин Виктор Алексеевич (RU), Барышников Анатолий Юрьевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное унитирное предприятие Государственный научно-исследовательский институт органической химии и технологии (ФГУП ГосНИИОХТ) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-04-28 публикация патента:
10.04.2007 |
Изобретение относится к области фармакологии, медицины и органической химии и касается средства, проявляющего иммуномодулирующие, противоопухолевые, бактериостатические и антиагрегантные свойства, представляющего собой бромид 1-гексадецил-R-(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана, и способа его получения путем кватернизации R-(-)-1-азабицикло [2.2.2]октан-3-ола бромистым гексадецилом при нагревании в органическом растворителе. Средство обладает низкой токсичностью, высокой эффективностью, не оказывает аллергезирующего действия и не обладает кумулятивным эффектом. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл.
Формула изобретения
1. Средство, проявляющее иммуномодулирующие, противоопухолевые, бактериостатические и антиагрегантные свойства, отличающееся тем, что оно представляет собой бромид 1-гексадецил-R-(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана
2. Способ получения бромида 1-гексадецил-R-(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана, заключающийся в том, что R-(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ол подвергают кватернизации бромистым гексадецилом при нагревании в органическом растворителе (например, этаноле или пропаноле), образующийся продукт фильтруют и очищают перекристаллизацией.
Описание изобретения к патенту
Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октана (далее вещество I) относится к кватернатам оптически активных бициклических аминоспиртов и может быть использован: в медицине в качестве химио- и радиопротектора в сочетании с химио- и лучевой терапией для улучшения качества жизни больных и уменьшения интервалов между курсами специфического лечения рака, при хирургическом лечении химиорезистентных форм рака (рак легкого, пищевода, желудка и т.д.) в качестве стимулятора противоопухолевого иммунитета у больных в послеоперационном периоде; для профилактики онкологических заболеваний у лиц с высоким фактором риска (генетическая предрасположенность к раку, профессиональные факторы и т.д.) на фоне мониторинга противоопухолевых составляющих иммунитета; при лечении иммунодефицитов и хронических инфекций различной природы; в качестве антикоагулянта у больных с повышенной свертываемостью крови для профилактики тромбообразования; в лабораторной практике: в качестве активатора натуральных киллеров и индуктора цитокинов (интерлейкинов, фактора некроза опухолей, интерферонов и т.д.)
В качестве аналогов вещества I могут рассматриваться иммуномодуляторы цитокиновой природы с противоопухолевой активностью. К таким соединениям относятся препараты интерлейкина-2 (Ронколейкин, Россия и Пролейкин, Голландия) и интерферона (Реоферон, Россия, Интрон-А, США). Эти препараты при воздействии в терапевтических дозах могут вызывать побочные реакции в виде лихорадки, снижения уровня артериального давления, почечной и дыхательной недостаточности (Биологические методы лечения онкологических заболеваний: Пер. с англ. /Под ред. В.Т.ДеВита, С.Хеллмана, С.А.Розенберга. - М.: Медицина, 2002. - Д.Дж.Шварцентрубер. Биологические методы лечения интерлейкином-2: клиническое применение, - с.247-262; К.А.Фун Биологические методы лечения интерфероном- и - : клиническое применение - с.382-390; X.Р.Кесада. Биологические методы лечения интерфероном- , с.452-460). Побочные эффекты этих рекомбинантных пептидов требуют проведения длительных (до 18 ч) инфузий или подкожных введений, при которых происходит потеря до 30% активности действующего начала (Справочник для иммунотерапии для практического врача./ Под ред. А.С.Симбирцева. - С.-П.: Диалог, 2002. - В.К.Козлов Ронколейкин: биологическая активность, иммунокорригирующая эффективность и клиническое применение). Кроме того, эти препараты при длительном применении вызывают образование антител, что снижает их эффективность (G. Sama at al. A comparative study of intravenous versus intralymphatic interleukin-2, with assessment of effects of interleukin-2 on both peripheral blood and thoracic-duct lymph. J. Immunother, 1994. - №15 - P.140-146). Рекомбинантные цитокины требуют особых условий хранения и транспортирования и не могут храниться в водных растворах. Известны также иммуномодуляторы не белковой природы (ликопид, полиоксидоний, иммунофан, неовир), которые используются для коррекции иммунного статуса у онкологических больных, однако их противоопухолевое действие не установлено (Добрица В.П., Ботерашвили Н.М., Добрица Е.В. Современные иммуномодуляторы для клинического применения: Руководство для врачей. -С.-П.: Политехника, 2001. - 251 с.; Справочник для иммунотерапии для практического врача. /Под ред. А.С.Симбирцева. - С.-П.: Диалог, 2002. - А.А.Старченко. Общая характеристика иммунотропных препаратов - с.100-151).
Вещество I в отличие от рекомбинантных цитокиновых противоопухолевых препаратов характеризуется низкой токсичностью и в дозах, в тысячи раз превышающих терапевтические, не оказывает токсического действия на системы жизнеобеспечения у лабораторных животных. Вещество I не вызывает гипертермических реакций у животных, не оказывает аллергезирующего действия и не обладает кумулятивным эффектом. Препарат высоко стабилен в водных растворах, не требует особых условий транспортирования и хранения, сохраняет свою биологическую активность в растворах не менее 3 лет. Вещество I наряду с иммуномодулирующим действием обладает противоопухолевой и бактериостатической активностью. Вещество I хотя и является синтетическим соединением с низкой молекулярной массой, наиболее близким по спектру биологической активности для него является рекомбинантный пептид ИЛ-2, который может рассматриваться в качестве его прототипа.
Препарат представляет собой индивидуальное органическое вещество - бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октана, см. фиг.1.
Способ получения. Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октана (I) получают кватернизацией R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (II) бромистым гексадецилом (III) по схеме 1 при нагревании в органическом растворителе, например, этаноле или изопропаноле. По окончании реакции продукт I отфильтровывают и очищают перекристаллизацией.
Схема 1
Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октан (I) имеет R- абсолютную конфигурацию хирального центра, и поэтому исходным веществом для его получения по схеме 1 является R(-)-1-азабицикло[2.2.2.]октан-3-ол (II).
Исходное вещество - R(-)-1-азабицикло[2.2.2.]октан-3-ол (II) выделяют при расщеплении RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (VII) через диастереомерные соли с хиральной кислотой (например, с R(-)- или S(+)-энантиомерами миндальной кислоты) в органическом растворителе(например, в ацетоне или метилэтилкетоне). При использовании для расщепления RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (VII) в качестве хирального расщепляющего реагента кислого характера R(-)- миндальной кислоты (VIII) по схеме 2 происходит преимущественная кристаллизация R(-) R(-) - диастереомерной соли (IX), которую отфильтровывают и очищают от второй S(+) R(-)-диастереомерной соли кристаллизацией.
Схема 2
Разложение диастереомерных солей производится в следующем порядке (схема 3). В начале из водного раствора диастереоизомерной соли действием разбавленной соляной кислоты регенерируют хиральный реагент (УТЛ), извлекая его эфиром. Затем из водного кислого раствора действием твердого едкого кали выделяют энантиомер 1-азабицикло[2.2.2.]октан-3-ола (II), который отфильтровывают и очищают перекристаллизацией.
Схема 3
Используемые для получения бромида 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) PS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, бромистый гексадецил и R(-)- и S(+)-миндальные кислоты являются доступными реагентами для органического синтеза.
Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана (I) представляет собой мелкокристаллическое химически и оптически стабильное вещество с температурой плавления Т пл.=228-230°С и удельным вращением (с 1.5, 50% С2Н5 OH), (с 1.5, C5H5 N-CH3OH, 1:1). Вещество растворимо в воде, метаноле, этаноле, хлороформе, пиридине, диметилсульфоксиде.
Пример 1. Бромид 1-гексадецил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2]октана.
Раствор 12,7 г (0,1 моля) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола и 33,6 мл (33,6 г, 0,11 моля) бромистого гексадецила в 50 мл изопропанола нагревают в колбе с обратным холодильником в течение 16 ч. Осадок отфильтровывают, промывают изопропанолом и сушат. Перекристаллизовывают из изопропанола. Получают 39,5 г. (91,3%) бромида 1-гексацедил-R(-)-3-окси-1-азониабицикло[2.2.2.]октана в виде мелкокристаллического вещества с Тпл . 229,2°С, (с 1.5, 96% С2Н5 OH), (с 1.5, 50% С2Н5 OH), (с 1.5, 50% C5H5 N- СН3ОН, 1:1)
Найдено, %: С64,18; Н 10,97; N 3,18; Br 18,60.
С23Н 46BrNO
Вычислено, %: С 63,87; Н 10,72; N 3.24; Br 18,47.
Пример 2.
R(-)- и S(+) - энантиомеры 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола (расщепление RS (±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола R(-)- и S (+) - миндальными кислотами).
К раствору 30,4 г (0,2 моля) R(-)- миндальной кислоты в 800 мл ацетона при перемешивании добавляют небольшими порциями 25,4 г (0,2 моля) RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. Перемешивание продолжают до полного растворения 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. Через 12 ч образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×30 мл) и сушат. Получают 27,8г кристаллов с Т пл. 111,8-112,3°С и (с 3, Н2О), которые растирают в порошок и перекристаллизовывают из 1200 мл ацетона. Через 12 ч отфильтровывают 21,4 г (-) (-) - соли с (с 3, Н2О). Вторую кристаллизацию проводят из 1000 мл ацетона. Через 12 ч выделяют 19,0 г (68,0%) R(-)-манделата R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Т пл.=120,8°С, (с 3, Н2О). Последующая кристаллизация не приводит к изменению Тпл. и соли.
Найдено, %: С 65,11; Н 7,52; N 4,89. С 7H13NO C7Н8О 3.
Вычислено, %: С 64,54; Н 7,58; N 5.05.
К 50, 4 мл 6%-ной соляной кислоты (0,085 моля) при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 19,0 г (0,068 моля) R(-)-манделата R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола. После полного растворения соли R(-) - миндальную кислоту экстрагируют эфиром (5×30 мл). Эфирные экстракты промывают насыщенным раствором хлорида натрия (2×10 мл). Эфир отгоняют. Остаток перекристаллизовывают из смеси гептан- ацетон (5:1). Получают 9,8 г R(-) - миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Тпл.=133,2°С, (c 3, Н2О).
К водному слою, оставшемуся после отделения R(-)- миндальной кислоты, при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 24,7 г (0,44 моля) твердого едкого кали. Всплывший осадок отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают из толуола. Получают 7,9 г (91,3%) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Тпл =222.3°С, (с 2, 1 н. СН3СО 2Н).
Первый ацетоновый маточный раствор, полученный после отделения 27,8 г (-) (-)-соли, упаривают на водяной бане, и из остатка действием 6%-ной соляной кислоты выделяют 14,4 г R(-)- миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Тпл .=133,4°С (из смеси гептан- ацетон (5:1)), (с 3, Н2О), а затем действием едкого кали - 11,6 г 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, обогащенного S(+) - энантиомером, Тпл.=222,5°С (из толуола), (с 2, 1 н. СН3CO 2Н, о. ч. 85,7%).
К раствору 13,9 г (0,091 моля) S(+) - миндальной кислоты в 800 мл ацетона при перемешивании добавляют небольшими порциями 11,6 г (0,091 моля 1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, обогащенного S(+)-энантиомером с (с 2, 1 н. СН3СО 2Н). Через 12 ч образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×20 мл) и сушат. Получают 21,9 г (+) (+)- соли с (с 3, Н2О). Последующая кристаллизация приводит к 19,4 г (82,0%) S(+) - манделата S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, Тпл=121,0°С, (c 3, Н2О).
К 51,5 мл 6%-ой соляной кислоты (0,087 моля) при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 19,4 г (0,069 моля) S(+) - манделата S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола, S(+) - миндальную кислоту экстрагируют эфиром (5×30 мл). Экстракт промывают насыщенным раствором хлорида натрия (2×10 мл). Эфир отгоняют. Остаток перекристаллизовывают из смеси гептан- ацетон (5:1). Получают 10,0 г S(+) - миндальной кислоты (регенерированный хиральный реагент), Тпл.=131,1°С, (c 3, H2O).
К водному слою, оставшемуся после отделения S(+) - миндальной кислоты, при перемешивании и охлаждении ледяной водой небольшими порциями добавляют 25,2 г (0,45 моля) твердого едкого кали. Всплывшее вещество отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают из толуола.
Получают 8,1 г (91,7%) S(+)-1-азабицикло[2.2.2.]октан-3-ола, Т пл=222,4°С, (с 2, 1 н. СН3СО 2Н).
Таким образом, при расщеплении 25,4 г RS(±)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола получают 7,9 г (62,2%) R(-)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола и 8,1 г (63,8%) S(+)-1-азабицикло[2.2.2]октан-3-ола.
Цель патентуемой разработки: создание нового синтетического низкомолекулярного препарата, обладающего выраженным стимулирующим действием на систему противоопухолевого иммунитета, не уступающего, а по возможности превосходящего по эффективности современные отечественные и зарубежные препараты - иммуномодуляторы, которые являются природными высокомолекулярными биологически активными веществами, полученными с помощью методов генной инженерии.
Была проведена оценка токсической и биологической активности вещества I.
Оценка испытаний вещества I на острую токсичность.
Результаты проведенных испытаний показали отсутствие половых различий в чувствительности животных к токсическому действию вещества I. Категории доз острой токсичности препарата для мышей и крыс представлены в таблице 1.
Таблица 1 | ||||
Категория доз | Мыши | Крысы | ||
подкожно | перорально | подкожно | перорально | |
ЛД16 , мг/кг | 330,0 | 202,0 | 230,0 | 470,0 |
ЛД50, мг/кг | 488,9 | 416,2 | 420,2 | 753,5 |
(360,1÷663,6) | (283,6÷610,8) | (264,1÷668,4) | (505,9÷1122,0) | |
ЛД84, мг/кг | 690,0 | 860,0 | 760,0 | 1200 |
В соответствии с табуляцией классов токсичности (Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия), М., 1970, стр.16) вещество I относится к классу «малотоксичных» веществ.
Влияние вещества I на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров.
На фиг. 1.1., 1.2, 1.3 и 1.4 показано стимулирующее действие вещества I на продукцию цитокинов интерлейкина-1 (ИЛ-1 ), интерферона- (ИФН- ), интерлейкина-2 (ИЛ-2), фактора некроза опухоли (ФНО- ) мононуклеарными клетками здоровых доноров, выделенных из периферической крови согласно методике [Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике. /Под ред. В.В.Меньшикова: Д.В.Белокриницкий «Методы клинической иммунологии». - М.: «Медицина», 1987. - с.307].
Количественное определение цитокинов в супернатанте мононуклеарных клеток, инкубированных с растворами вещества I (диапазон концентраций 10-4-10-8 М), по методике [Шпакова А.С., Павлова К.С., Булычева Т.И., ж. «Клиническая лабораторная диагностика», №2, 2000. - с.20-23], проводили с использованием твердофазного иммуноферментного метода с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента [«Иммунология» под ред. У.Пола в 3-х т. - М., «Мир», 1989, т.3, гл. 28, с.260, Ed.W.Paul «Fundamental Immunology» - Raven Press, N.Y., 1984 ].
Соотношение клеток - мишеней и клеток - эффекторов 1:10, контроль - с добавлением физиологического раствора хлорида натрия (0,9% NaCl).
Таблица 2 Количество выживших мышей с привитой опухолью Эрлиха. | |||||||||
Время, сут. | 14 | 15 | 16 | 19 | 20 | 22 | 25 | 26 | Выжило |
Контроль | 6/0 | 6/1 | 5/2 | 3/2 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1 |
Пролейкин | 6/1 | 5/0 | 5/0 | 5/1 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 4 |
Вещество I | 7/2 | 5/1 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 4 |
Динамика роста опухоли у животных, леченных препаратом Пролейкин и веществом I, была достоверно меньше по сравнению с контрольной группой.
Вещество I оказывало тормозящее влияние на динамику роста опухоли меланомы В-16 у мышей гибридов F1 и увеличивал продолжительность их жизни. В частности, в дозе 0,005 мг/кг отмечено торможение опухолевого роста на 80%. Гибель животных в контрольной группе наступала на 19 сут., в то время как мыши, получавшие вещество I в указанной дозе, оставались живы до 25 сут. (см. фиг.3.1 и 3.2).
Таким образом, вещество I в дозах 0,05-0,005 мг/кг оказывает сходное цитостатическое действие по сравнению с препаратом Пролейкин при испытании на мышах с привитыми опухолями и вызывает стимуляцию противоопухолевого иммунитета.
Противоопухолевую активность также изучали на мышах-самцах линии СВА, которым подкожно перевивали аденокарциному яичников СаО-1. Опухоль была получена на потомстве мышей-самок линии СВА, которым во время беременности вводили эстрогены. Опухоль по гистологическому строению, клиническому течению и даже антигенному строению близка к раку яичника человека (БЭБиМ. - 2000 г., №129, стр.456-459). Опухолевые клетки перевивали в количестве 1 млн. клеток/ мышь.
Лечение осуществляли по схеме:
Мышам (30 штук) через 24 часа после перевивки опухолевых клеток начинали вводить разведенный в физиологическом растворе вещество I подкожно в 0.2 мл в нечетные дни (1-й, 3-й, 5-й и т.д.). Всего 7 введений. В контрольной группе животным вводили в этом же режиме физиологический раствор (растворитель препарата) (20 штук). Препарат вводили в трех дозах: 0,005 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг.
Оценку действия препарата на рост опухоли проводили по регистрации различий в скорости роста опухоли. Расчет объема опухоли осуществляли по формуле:
V=ав2 (усл.ед).
Объем опухоли измеряли на 10,12 и 15 дни после перевивки. Результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3 Общие характеристики животных и влияния вещества I на рост аденокарциномы яичников СаО-1. | ||||
Название группы | Число животных | (Исходный) Средний вес 1 | Первое измерение опухоли (усл.ед) 2 | Третье измерение опухоли (усл.ед) 2 |
Контроль с физ. раствор. | 20 | (28,7+1,3)28,9 и 31.2 | 3110±237 | 8342±770 |
группа 0,005 | 10 | (27,6±1.1) | 1998±244 | 5663±708 |
мг/кг | 29.7 и 30.2 | |||
группа 0,05 | 10 | (28,4±0,6) | 1789±250 | 4882±673 |
мг/кг | 29.5 и 30.7 | |||
группа 0,5 мг/кг | 10 | (28,3±0,8) | 1545±183 | 5039±523 |
29.6 и 30.8 | ||||
1 - в скобках указан исходный средний вес животных в группе, а вне скобок на 10 и 15 дни после трансплантации в граммах. | ||||
2 - измерения объема опухоли проводили на 10 и 15 дни после трансплантации. |
Вещество I замедляет рост аденокарциномы яичников СаО-1.
Торможение роста опухоли на 10-й день измерения составило 42%, 45%, 52%, на 12-й день 43%, 49%, 45%, а на 15-й день 32%, 42%, 40% для режимов 0,005 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг соответственно. Данный эффект является пограничным эффектом для цитостатиков. Токсического действия препарата не обнаружено.
Приведенные выше примеры свидетельствуют о выраженной противоопухолевой активности вещества I
Изучение влияния вещества I на фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов крови здоровых доноров.
Данное исследование проводилось в 2 этапа: изучение влияния препарата на бактерицидную активность нейтрофилов и воздействие вещества I на способность нейтрофилов к захвату частиц латекса.
Для выделения нейтрофилов из венозной крови здорового донора получали лейкоконцентрат по методике [Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии/Под редакцией профессора А.И.Карпищенко. - Санкт-Петербург: Интермедика, 2002. - 408 с.]. Его разводили физиологическим раствором рН 7,2 до концентрации 5×104 лейкоцитарных клеток в 1 мкл. Полученную суспензию по 180 мкл разливали в лунки 24-х луночной плашки Falcon, получая, таким образом, 4 параллельных ряда по 6 лунок. Затем в лунки добавляли вещество I в различной концентрации действующего вещества (10-3 -10-7 М) по 20 мкл, в последние в ряду лунки вносили 0,9% р-р хлорида натрия в качестве контроля.
Для изучения бактерицидной активности клеток вносили во все лунки по 10 мкл взвеси суточной агаровой дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae (2×1011 кл/мл). Описанные манипуляции проводились с соблюдением условий стерильности.
Планшет с клетками термостатировали в течение 6 часов при 37°С. Далее удаляли пипеткой супернатант из лунок, из осадка готовили тонкие мазки, которые фиксировали в смеси Никифорова (5-10 мин) и окрашивали по Романовскому - Гимзе [В.С.Ронин, Г.М.Старобинец, Н.Л.Утевский/Руководство к практическим занятиям по методам клинических лабораторных исследований. - М.: Медицина, 1977, 335 с.].
Учет результатов проводили следующим образом: при микроскопировании окрашенных мазков учитывают 100 нейтрофилов, в которых подсчитывают количество клеток с признаками фагоцитоза.
Поглотительную способность фагоцитов оценивают с помощью фагоцитарного показателя. Фагоцитарный показатель (ФП) - процент фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов.
Результаты исследований приведены в таблице 4.
Таблица 4 Влияние на бактерицидную активность нейтрофилов крови человека вещества i | ||||
Действующая концентрация вещества I | Номер опыта | |||
1 | 2 | |||
Среднее значение | Доверительный интервал | Среднее значение | Доверительный интервал | |
10-4 | 64,8 | 5,8 | 70,2 | 2,4 |
10 -5 | 54,5 | 5,5 | 51,0 | 1,4 |
10-6 | 45,0 | 5,5 | 41,8 | 0,5 |
10-7 | 38,0 | 5,0 | 41,5 | 1,0 |
10-8 | 32,0 | 3,3 | 39,3 | 1,9 |
Контроль | 33,0 | 5,5 | 41,0 | 2,4 |
Из данных таблицы 4 следует, что совместная инкубация лейкоцитов с веществом I достоверно повышает способность нейтрофилов к поглощению микроорганизмов по сравнению с контролем.
Кроме того, было проведено исследование влияния изучаемого препарата на способность нейтрофилов к захвату опсонизированных частиц латекса. Для этого в лунки с фагоцитами, активированными изучаемым препаратом, вносили по 10 мкл взвеси опсонизированных частиц латекса в физиологическом растворе (концентрация частиц составляла 5000 в 1 мл). Фагоциты инкубировали с латексом в течение 8 ч. Результаты проведенного теста представлены в таблице 5.
Таблица 5 Влияние вещества I на способность нейтрофилов фагоцитировать частицы латекса. | |||||||||
Действующая концентрация вещества I | Фагоцитарный показатель, % | р | |||||||
Номер опытной пробы | Среднее значение | ||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |||
10 -4 | 92 | 60 | 90 | 60 | 100 | 100 | 80 | 83 | 0,0006 |
10-5 | 45 | 45 | 50 | 50 | 60 | 65 | 43 | 51 | 0,0356 |
10-6 | 80 | 40 | 30 | 30 | 20 | 30 | 35 | 38 | 0,2362 |
10-7 | 60 | 40 | 10 | 20 | 20 | 40 | 41 | 33 | 0,3535 |
10-8 | 30 | 30 | 0 | 0 | 20 | 25 | 48 | 22 | 0,3262 |
10-9 | 30 | 40 | 0 | 0 | 15 | 20 | 32 | 20 | 0,2705 |
Контроль | 50 | 80 | 0 | 0 | 10 | 40 | 18 | 28 |
Из данных статистической обработки результатов таблиц 4 и 5 следует, что совместная инкубация лейкоцитов с веществом I в действующих концентрациях 10-4-10-5 М достоверно повышает фагоцитарную активность нейтрофилов, увеличивая ФП по сравнению с контролем.
Бактериостатическая активность вещества I
В проведенной серии экспериментов была исследована чувствительность к веществу I штаммов микроорганизмов, выделенных из патологического материала от больных (экссудат, транссудат, кровь, моча, содержимое толстого кишечника, раневое отделяемое, слизь из зева) в послеоперационный период, и с предметов, окружающих больного в этот период - из воздуха, с предметов ухода за больными, с перевязочного материала, смывы с рук (санитарная группа микроорганизмов).
Видовой состав используемых штаммов бактериальных культур определялся исходя из того, что до недавнего времени основной причиной возникновения инфекций у больных являлись грамотрицательные бактерии, в частности псевдомонады, кишечная палочка, а в настоящее время все возрастающую отрицательную роль играют грамположительные бактерии (мецитиллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка, энтерококки и др.). Эти бактериальные штаммы характеризуются антибиотикорезистентностью к широкому спектру химиопрепаратов.
Бактериостатическое воздействие вещества I на рост штаммов микроорганизмов определяли согласно луночно - диффузной методике [В.S.Reisner, Gl. Woods, R.В.Thomson - Specium Processing in Manual of Clinical Microbiology - Washington, 1999, 64-104; Сидоренко С.В., Колупаев В.Е. - Антибиотикограмма: Диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов. - 1999]
Таблица 6 Бактериостатическая активность вещества I по отношению к микроорганизмам - возбудителям внутрибольничных инфекций (ВБИ) и микроорганизмам санитарной группы. | |||||||||
Степень разведения препарата, М | Группа ВБИ | Санитарная группа | |||||||
Ent. Faecalis | St. Aureus | Ent. Epidermidis | Е.coli | Cl. aeruginosae | Е.coli | Ent. Faecalis | St. Epidermidis | Micr. Geminis | |
10-3 | ++ | ++ | - | - | - | ||||
10-4 | + | - | ++ | ++ | |||||
10-5 | + | - | + | - | - | ++ | + | + | |
10-6 | ++ | - | - | + | - | + | + | + | - |
10-7 | ++ | - | - | + | - | + | + | - | ++ |
10-8 | + | - | + | + | - | + | + | - | - |
10-9 | + | - | + | - | - | + | + | + | ++ |
10-10 | + | - | + | - | - | + | + | ++ | - |
10-11 | + | - | - | ++ | - | + | + | ++ | ++ |
10-12 | + | - | - | + | - | ++ | + | ++ | + |
10-13 | - | - | - | + | - | + | + | - | - |
++ штамм, чувствительный к действию тестируемого препарата | |||||||||
+ штамм, умеренно чувствительный к действию тестируемого препарата | |||||||||
- штамм, устойчивый к действию тестируемого препарата |
Вещество I характеризуется высокой бактериостатической активностью и широким спектром действия по отношению к большинству исследованных штаммов микроорганизмов.
Антитромбоцитагрегирующее действие вещества I
Вещество I оказывает активное антитромбоцитагрегирующее действие. Оно снижает агрегацию, вызываемую адреналином, АДФ и практически на 100% тормозит агрегацию, индуцируемую фактором агрегации тромбоцитов (ФАТ) и тромбином (см. фиг.4). Индекс антитромбоцитагрегирующей активности вещества I по тромбину и ФАТ равен 1×10 -11 М, что относит препарат к разряду активных антагонистов ФАТ.
Таким образом, к преимуществам вещества I можно отнести: высокую иммуномодулирующую и противоопухолевую активность, бактерицидное и антиагрегантное действие, низкую токсичность, высокую стабильность в водных растворах, простую технологию получения.
Результаты, представленные на фиг.1.1,1.2,1.3,1.4, свидетельствуют о стимулирующем влиянии вещества I на продукцию мононуклеарными клетками цитокинов ИЛ-1 , ИЛ-2, ИФН- и ФНО- , обладающих иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами. Этот эффект выражен наиболее ярко при действующей концентрации вещества I в супернатанте в диапазоне 10-4 -10-7 М.
Влияние вещества I на естественную киллерную активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.
На фиг. 2 показано стимулирующее влияние вещества I на естественную киллерную активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров, выделенных согласно методике [«Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике.» под ред. В.В.Меньшикова: Д.В.Белокриницкий «Методы клинической иммунологии». - М., «Медицина», 1987, с.307].
Количественное определение цитотоксической активности естественных киллерных клеток, инкубированных с растворами вещества I (диапазон концентраций 10-4-10-8 М) (контроль - с 0,9% NaCl), проводили с использованием МТТ-колориметрического теста по методике [Шпакова А.С., Павлова К.С., Булычева Т.И., ж. «Клиническая лабораторная диагностика», №2, 2000, с.20-23].
Наиболее оптимальные соотношения «опухолевая клетка/естественная киллерная клетка» - 1:10 и 1:5, при которых цитотоксическая активность МНК совместно инкубированных с тестируемым препаратом достигает наибольшего значения.
Максимальный, стабильно воспроизводимый эффект повышения противоопухолевой активности естественных киллеров отмечается при воздействии на МНК вещества I в диапазоне концентраций 10-4-10-6М.
Вещество I не оказывает прямого цитотоксического воздействия на изолированные мононуклеарные клетки крови и опухолевые клетки.
Изучение противоопухолевой активности вещества I
Исследование противоопухолевого эффекта проводили на мышах линии СВА и гибридах F1 весом 20-25 г. Животные содержались согласно «Правилам доклинических испытаний фармакологических препаратов» (PD 64-126-91).
Клетки опухоли Эрлиха вводили внутрибрюшинно (ip), а меланомы В 16 - подкожно (sc) в дозе 2 млн./мышь. Опытные и контрольные группы состояли из 6-10 животных. Контрольной группе вводили физиологический раствор. Действие тестируемых образцов сравнивали с эффектом препарата Пролейкин, Голландия (ИЛ-2). Наблюдение осуществлялось в течение 1 мес после трансплантации опухоли. Оценку состояния животных производили визуально. Динамику роста опухолевой массы оценивали по весу животных.
Изучение противоопухолевой активности вещества I в отношении опухоли Эрлиха проводили на мышах линии СВА в дозе 0,05 мг/кг, а Пролейкин в дозе 10000 МЕ/ мышь. Тестируемые вещества вводили за 3-е сут. до и на 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 17, 18 и 20 сут после трансплантации опухоли. В контрольной группе на 15-е сут осталась жива одна особь из 6. В группе мышей, получавших вещество I в указанной дозе, погибло 3 из 7 мышей. Среди животных, получавших Пролейкин к 20 сут. погибло 2 из 6 особей.
Класс C07D453/02 содержащие хинуклидиновые циклические системы, не конденсированные с другими кольцами
Класс A61K31/439 кольцо, являющееся частью мостиковой кольцевой системы, например хинуклидин
Класс A61K31/14 четвертичные аммониевые соединения например эдрофониум, холин
Класс A61P37/02 иммуномодуляторы