способ определения динамики скрытой активности изоферментов лдг гомогената лейкоцитов

Формула изобретения

Способ определения динамики скрытой активности изоферментов ЛДГ гомогената лейкоцитов путем разделения изоферментов ЛДГ методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле и последующего выявления активностей изоферментов методом восстановления нитросинего тетразолия с образованием в геле гранул формазана, отличающийся тем, что перед проведением электрофореза гомогенат лейкоцитов разделяют на 8 равных аликвот, три из которых инкубируют 15 мин при 37°С с мочевиной в концентрациях 1, 2, 3 моль, следующие три аликвоты инкубируют при тех же условиях с мочевиной в концентрациях 1, 2, 3 моль в присутствии детергента тритон N-101 в рабочей концентрации 1%, затем анализируют разницы активностей соответствующих изоферментов ЛДГ, выявляемых в геле после инкубации гомогената лейкоцитов с соответствующими концентрациями мочевины с детергентом и без него; из оставшихся двух аликвот одну инкубируют 15 мин при 37°С без добавления реагентов, а другую инкубируют при тех же условиях в присутствии детергента тритон N-101 в рабочей концентрации 1%, затем вычисляют разницу активностей соответствующих изоферментов ЛДГ, выявляемых в геле после инкубации гомогената лейкоцитов без добавления реагентов и с детергентом.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к биологии, а именно к биохимии, и может быть использовано для изучения агрегатного состояния клеточного гомогената в диагностических целях при всех видах патологии, сопровождающихся изменением клеточного гомеостаза.

Известны способы разделения изоферментов лактатдегидрогеназы с использованием электрофореза в полиакриламидном геле [Райдер К., Тейлор К. - Изоферменты (Пер. с англ.). - М.: Мир. - 1983. - С.99-102].

Данный способ является наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является то, что он не позволяет изучать динамику скрытой активности ферментов.

Задачей предлагаемого изобретения является определение динамики скрытой активности изоферментов ЛДГ гомогената лейкоцитов.

Поставленная задача достигается путем разделения изоферментов ЛДГ методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле и последующего выявления активностей изоферментов методом восстановления нитросинего тетразолия с образованием в геле гранул формазана.

Перед проведением электрофореза гомогенат лейкоцитов разделяют на 8 аликвот. Три аликвоты инкубируют 15 минут при 37°С с мочевиной в концентрациях 1, 2, 3 моль, а следующие три аликвоты инкубируют с теми же концентрациями мочевины и при тех же условиях в присутствии детергента тритон N-101 в рабочей концентрации 1%. Затем вычисляют разницу активностей соответствующих изоферментов ЛДГ, выявляемых в геле после инкубации гомогената лейкоцитов с соответствующими концентрациями мочевины в присутствии детергента и без него.

Из оставшихся двух аликвот одну инкубируют 15 минут при 37°С без добавления реагентов, а другую инкубируют при тех же условиях в присутствии детергента тритон N-101 в рабочей концентрации 1%. Затем вычисляют разницу активностей соответствующих изоферментов ЛДГ, выявляемых в геле после инкубации гомогената лейкоцитов без добавления реагентов и с детергентом.

Новым в предлагаемом способе является:

1) инкубация гомогената лейкоцитов с мочевиной в концентрациях 1, 2, 3 моль;

2) инкубация гомогената лейкоцитов с мочевиной в концентрациях 1, 2, 3 моль в присутствие детергента тритон N-101 в рабочей концентрации 1%;

3) инкубация аликвот клеточного гомогената перед проведением электрофореза с реагентами 15 минут при 37°С.

Метод солюбилизации мембранных белков детергентами используется для выявления латентной (скрытой) активности [Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов: Учебное пособие. - М.: Изд-во МГУ. - 1985. - С.76-77], а также при электрофоретическом разделении мембранных белков в денатурирующих условиях.

Для представляемого метода величина скрытой активности фермента является показателем, отражающим агрегатное состояние гомогената лейкоцитов.

При выделении изоферментов ЛДГ из гомогената лейкоцитов методом нативного электрофореза определенная часть изоферментов ЛДГ не входит в гель, поскольку находится в связанном с мембраной и другими белками состоянии. Если к гомогенату лейкоцитов перед проведением электрофореза добавить детергент, то связанная часть фермента солюбилизируется и в процессе электрофоретического разделения войдет в гель. В этом случае выявляемая в геле активность изоферментов станет выше и будет соответствовать реально находившемуся в клеточном гомогенате количеству фермента.

Прирост выявляемой в геле активности соответствующего изофермента ЛДГ после инкубации гомогената лейкоцитов с детергентом в представляемом методе принято называть скрытой активностью (СА).

Гомогенат лейкоцитов является гетерогенной системой в определенном агрегатном состоянии [Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. - М.: - Мир. - 1997. - С.24-25]. Детально особенности агрегатного состояния гомогената лейкоцитов можно оценить путем сравнения величин деструктурирующего влияния соответствующих концентраций хаотропного агента - мочевины (1, 2, 3 моль) на соответствующие изоферменты ЛДГ гомогената лейкоцитов, находящегося в разных агрегатных состояниях.

В представляемом методе деструктурирующее влияние мочевины на фермент изучают у гомогенатах лейкоцитов, находящихся в двух разных агрегатных состояниях. В первом случае это гомогенат лейкоцитов в нативном состоянии (АС1), а во-втором после добавления к нему детергента (АС2).

В энзимологии по степени уменьшения активности фермента после инкубации с мочевиной судят о его стабильности. Однако эти исследования проводятся на очищенных ферментах. Принципиальным отличием предлагаемого метода является отсутствие предварительного выделения фермента из клеточного гомогената. Очевидно, что в этих условиях степень деструктурирующего влияния одной и той же концентрации мочевины на фермент будет определяться особенностями агрегатного состояния гомогената лейкоцитов, с одной стороны, и стабильностью изучаемого фермента, с другой.

Агрегатное состояние гетерогенной системы определяется ее химическим составом [Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями// Биохимия. - 1998. - Том 63. - Вып. - 3. - С.414-415]. Очевидно, что агрегатное состояние нативного гомогената лейкоцитов будет определяться химическим составом мембран и содержимого этих клеток.

Добавление к гомогенату лейкоцитов детергента приведет к изменению его агрегатного состояния, обусловленному солюбилизацией белков из белок-липидных и белок-белковых комплексов. Для солюбилизации белков традиционно используются неионные детергенты. Подбор концентрации детергента производится исходя из количества белка в клеточном гомогенате, т.е. необходимо соблюдение соотношения белок/детергент, поскольку от этого зависит эффективность солюбилизации, и, соответственно, степени выявления скрытой активности фермента [Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов. - М.: Изд-во МГУ. - 1985. - С.76-79].

Критерием выбора минимальной концентрации мочевины является минимальное, почти отсутствие, деструктурирующее влияние на фермент, а для максимальной - близкое к полному (полное) разрушение изучаемого фермента во время инкубации. Остальные (в данном патенте одна) концентрации мочевины выбираются между минимальной и максимальной концентрациями. Очевидно, что чем больше концентраций хаотропного агента используется, тем полнее описание ДСА. Количество концентраций хаотропного агента ограничено, с одной стороны, количеством биологического материала (гомогената лейкоцитов) и возможностями электрофореза, с другой.

1. Адаптационная реакция организма влечет за собой изменение функционального состояния иммуноцитов.

2. От метаболического гомеостаза иммуноцитов зависит химический состав мембран и содержимого этих клеток.

3. Химический состав мембран и содержимого иммуноцитов определяет агрегатное состояние гомогената этих клеток.

Из этих утверждений в сочетании с вышеизложенным материалом вытекает возможность использования представляемого способа в здравоохранении для изучения агрегатного состояния клеточного гомогената с диагностической целью и прогнозизования течения патологического процесса при всех видах патологии, сопровождающихся изменением клеточного гомеостаза.

Очевидно, что в представляемом методе новые признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из методического уровня в данной области и не очевидные для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в изученной патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое решение соответствующим критериям патентоспособности: новизна, изобретательский уровень и промышленная применимость.

Изобретение будет понятно из приложенных к нему чертежей.

Фиг.1. Энзимограмма изоферментов ЛДГ лейкоцитов.

Фиг.2. Скрытая активность изоферментов ЛДГ гомогената лейкоцитов.

Фиг.3. Динамика скрытой активности изоферментов ЛДГ гомогената лейкоцитов.

Пример конкретного выполнения предлагаемого способа.

Для исследования из локтевой вены берут 8 мл гепаринизированной крови. Лейкоциты получают разделением в градиенте плотности. Выделенные лейкоциты, около 20 млн клеток, разрушают гипотоническим шоком в 100 мкл дистиллированной воды в сочетании с вибрацией (3 мин).

Полученную лейкоцитарную массу разделяют на 8 аликвот по 50 мкл. Во все аликвоты добавляют по 50 мкл инкубационного раствора (ИР) разного состава.

Каждый ИР состоит из "общих" и "индивидуальных" компонентов. Общие компоненты - буфер (0,25 М трис-HCl (рН 6,8)) и глицерин (20%), присутствуют во всех ИР, а "индивидуальные" добавляются в зависимости от номера ИР.

В ИР №1 "индивидуальные" компоненты отсутствуют,

ИР №2 - мочевина (2 моль),

ИР №3 - мочевина (4 моль),

ИР №4 - мочевина (6 моль),

ИР №5 - тритон N101 (2%),

ИР №6 - тритон N101 (2%) и мочевина (2 моль),

ИР №7 - тритон N101 (2%) и мочевина (4 моль),

ИР №8 - тритон N101 (2%) и мочевина (6 моль).

К каждой из восьми аликвот добавляют один из вышеперечисленных растворов и полученные пробы (100 мкл каждая) инкубируют в течение 15 минут при 37°С. Данный режим признан оптимальным для выбранных реагентов и используемого количества биологического материала.

Концентрация неионного детергента (1%) подобрана экспериментальным путем исходя из принципа наиболее эффективной солюбилизации и, соответственно, степени выявления скрытой активности фермента. Минимальная (1 моль) и максимальная (3 моль) концентрации мочевины также подобраны экспериментальным путем исходя из минимума и максимума (соответственно) их деструктурирующего влияния на изучаемый фермент. Дополнительно выбрана концентрация 2 моль. Данный набор концентраций является минимальным для оценки динамики скрытой активности.

После инкубации проводят разделение изоферментов ЛДГ с использованием метода нативного электрофореза в пластинах полиакриламидного геля с применением прерывистой буферной системы. Рабочий гель представляет собой 7,5% раствор полиакриламида в 0,375 М трис-HCl буфере с рН 8,8, а фокусирующий - 3% раствор полиакриламида в 0,125 М трис-HCl буфере с рН 6,8. Электродным буфером служит трис-глициновый буфер с рН 8,3. Электрофоретическое разделение ведется при напряжении электрического тока 1-1,5 вольт/см геля, время электрофоретического разделения около 14-16 часов.

Выявление в геле активности изоферментов лактатдегидрогеназы проводят полуколичественным методом, использующим реакцию восстановления нитросинего тетразолия. Гели помещают в инкубационный раствор следующего состава: в 2-х мл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 8,0 растворяют 3 мг лактата, 0,4 мг NAD+ и добавляют 20 мкл 1% раствора нитросинего тетразолия. Инкубируют в течение 20 минут при температуре 37°С в темноте, после этого добавляют 10 мкл 1% раствора феназинметасульфата и продолжают инкубацию до 30 мин, затем гели с выявленными изоформами фиксируют в 7% растворе уксусной кислоты.

Гели с выявленными изоформами подвергают черно-белому варианту сканирования. На энзимограмме уверенно выявляются 3-и изофермента ЛДГ (ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3). ЛДГ-4 встречалась только в 5% случаев, а ЛДГ-5 не удалось выявить ни разу (фиг.1).

Определяемые показатели. Скрытая активность (СА). Величину СА определяют по разнице интенсивности соответствующих изоформ (после инкубации разрушенных клеток в одном случае с детергентом, в другом - без него) в процентах (Растворы №5 и 1 соответственно). Интактная активность соответствующего изофермента (Раствор №1) принимают за 100%.

Динамика СА (ДСА). Агрегатное состояние нативного гомогената лейкоцитов принято в данном методе называть АС1, а агрегатное состояние гомогената лейкоцитов в присутствии детергента - АС2.

Зависимость выявляемой активности ЛДГ от концентрации мочевины (Растворы №2, 3, 4) принимают за стабильность фермента при АС1 (Стаб.АС1). Измеряют в %, за 100% принимают интактную активность (Раствор №1) соответствующего изофермента.

Зависимость выявляемой активности ЛДГ от концентрации мочевины, получаемую в случае инкубации гомогената лейкоцитов с мочевиной в присутствии детергента (Растворы №6, 7, 8), принимают за стабильность фермента при АС2 (Стаб.АС2). Измеряют в %. За 100% принимают выявляемую активность соответствующего изофермента после его инкубации с детергентом (Раствор №5).

Разницу выявляемых активностей соответствующих изоферментов ЛДГ и при соответствующих концентрациях мочевины между зависимостями Стаб.АС1 и Стаб.АС2 принимают за скрытую активность (СА). Изменение величин СА по мере увеличения концентрации мочевины принимают за динамику скрытой активности (ДСА). ([ДСА]=[Стаб.АС1]-[Стаб.АС2]). Измеряют в %.

С помощью специальной компьютерной программы вычисляют активность изоферментов, пропорциональную плотности изображения их бэндов на единицу площади (Таблица 1).

В верхней части таблицы в условных единицах (у.е.) представлены активности изоферментов. В нижней части таблицы представлены те же активности изоферментов, но в %, относительно активностей соответствующих изоферментов ЛДГ, инкубировавщихся без реагентов (ИР №1), для Стаб.АС1 и инкубировавщихся с детергентом (ИР №5), для Стаб.АС2.

В Таблице 2 представлены столбцы с инкубациями ИР №1 и ИР №5 и соответствующими значениями активностей изоферментов в у.е. и в % для облегчения понимания способа вычисления величин СА.

В Таблице 3 представлены столбцы с инкубациями ИР №2-4 и ИР №6-8 и соответствующими значениями активностей изоферментов в % для облегчения понимания способа вычисления величин ДСА.

На фиг.2 и 3 представлены графические изображения величин СА и ДСА изоферментов ЛДГ.

Представленный метод апробирован на 27 психически больных, и была показана достоверная разница ДСА в сравнении с группой контроля.

Таблица 1. Результаты компьютерной обработки энзимограммы.
	ИР №1	ИР №2	ИР №3	ИР №4	ИР №5	ИР №6	ИР №7	ИР №8
	Конт-	1 моль	2 моль	3 моль	ТН	1 моль	2 моль	3 моль
	роль	Мочеви	Мочеви	Мочеви	N-101	Моч. +	Моч. +	Моч. +
		на.	на.	на.	1%	N101	N101	N101
						(1%)	(1%)	(1%)
ЛДГ 4	0	0	0	0	0	0	0	0
у.е.
ЛДГ 3	0,25	0,25	0,03	0	0,4	0,53	0,14	0
у.е.
ЛДГ 2	0,26	0,28	0,12	0	0,4	0,53	0,34	0
у.е.
ЛДГ 1	0,05	0,05	0,05	0,02	0,11	0,14	0,11	0,06
у.е.
ЛДГ 4%	0	0	0	0	0	0	0	0
ЛДГ 3%	100	100	12	0	100	133	35	0
ЛДГ 2%	100	108	46	0	100	133	85	0
ЛДГ 1%	100	100	100	40	100	127	100	54,6

Таблица 2. Определение СА изоферментов ЛДГ гомогената лейкоцит
	ИР №1	ИР №5
	Контроль	THN-101 1%
ЛДГ	0	0
4
у.е.
ЛДГ	0,25	0,4
3
у.е.
ЛДГ	0,26	0,4
2
у.е.
ЛДГ	0,05	0,11	СА
1			%
у.е.
ЛДГ	0	0	0
4
%
ЛДГ	100	160	60
3
%
ЛДГ	100	154	54
2
%
ЛДГ	100	220	120
1
%

	Таблица 3. Определение ДСА изоферментов ЛДГ гомогената лейкоцитов.
	Стаб.АС1			Стаб.АС2			ДСА
	ИР №2	ИР №3	ИР №4	ИР №6	ИР №7	ИР №8	СА1 моль Моч.	СА2 моль Моч.	СА3 моль Моч.
ЛДГ 4%	0	0	0	0	0	0	0	0	0
ЛДГ 3%	100	12	0	133	35	0	33	23	0
ЛДГ 2%	108	46	0	133	85	0	25	39	0
ЛДГ 1%	100	100	40	127	100	54,6	27	0	14,6