способ отбора микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов

Формула изобретения

Способ отбора микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов путем оценки их биологических свойств, отличающийся тем, что в качестве критерия отбора используют способность данных микроорганизмов предупреждать нарушения минерального обмена со стороны макроорганизма, перорально получающего подобные пробиотические препараты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области микробиологических технологий, а именно к способам отбора штаммов живых апатогенных микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов медицинского или ветеринарного назначения.

В частности, изобретение предназначено для отбора живых микроорганизмов, особенностью которых является их способность при пероральном применении усиливать процессы усвоения минеральных веществ.

Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в лабораториях биологического и медицинского профиля, решающих вопросы создания новых живых пробиотических препаратов с заранее заданными свойствами.

Известен способ отбора штаммов микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов, предусматривающий отбор штаммов микроорганизмов по их способности снижать содержание холестерина в тканях животных или птиц, предусматривающий проведение следующей двухстадийной процедуры (Герасименко В.В. Обмен веществ и продуктивность гусей, выращиваемых на мясо, при использовании лактоамиловорина. Автореф. дисс.... канд. биол. наук, Боровск, 2002. - 25 с.).

На первом этапе опытной группе птиц (гусят) сразу после вылупления выпаивают изучаемый пробиотический штамм в количестве 70 г биомассы на 10 л воды при ее неограниченном потреблении, а в дальнейшем аналогичное количество микроорганизмов в дозе 70 г/т комбикорма скармливают в течение первого месяца жизни. В частности, авторами использовался апатогенный микроорганизм Lactobacillus amylovorum (коммерческое название "Лактоамиловорин") с титром 0,24-4,26*10¹⁰ колониеобразующих единиц в 1 г. Контрольную группу составляла аналогичная по численности, срокам вылупления, условиям содержания и общему уровню кормления группа гусят, сформированная методом пар-аналогов.

На втором этапе в 180-дневном возрасте был проведен убой птицы опытной и контрольных групп с последующим определением содержания различных химических веществ в мышечной ткани. При этом скармливание лактоамиловорина вело к тому, что мясо гусей опытной группы в своем составе содержало на 3,35% меньше воды и на 3,0% меньше общих жиров, но на 5,72% больше протеинов, чем мясо гусей контрольной группы. На этом фоне наиболее ярким было различие в содержании холестерина, количество которого в мясе гусей опытной группы было на 49,6% ниже, чем в контроле (Р<0,01), что было расценено авторами как достижение особых диетических свойств подобного мяса.

Наиболее вероятной причиной снижения усвоения липидов корма у гусей опытной группы является способность различных видов лактобацилл к деконъюгации желчных кислот, таких как таурохолиевая и гликохолиевая (Gilliland S.E. "Health and nutritional benefis from lactic acid bacteria" // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V.87. №1-2. P.175-188). А так как последние обеспечивают всасывание липидов, при их деконъюгации под действием пробиотических штаммов относительно большее количество жиров (в т.ч. холестерина) проходит через желудочно-кишечный тракт транзитом, не всасываясь в кровь и не аккумулируясь в тканях.

Недостатком данного способа является то, что подобный способ не позволяет оценить влияние пробиотических штаммов микроорганизмов на всасывание различных макро- и микроэлементов, что положено в основу заявляемого способа. При этом основной причиной, препятствующей получению требуемого результата при использовании способа-прототипа, является отсутствие адекватного подхода, позволяющего зарегистрировать изменения минерального обмена, происходящие в отсутствие исследуемого штамма, а также на фоне его применения. В этой связи следует также отметить, что различия по содержанию минеральных веществ в мышечной ткани описанных выше опытной и контрольной групп гусей были статистически недостоверны (Георгиевский В.И. и др. Минеральное питание животных. М.: Колос, 1979. - 471 с.).

Технический результат изобретения - повышение качества пробиотических препаратов за счет придания им способности предупреждать и корректировать нарушения обмена минеральных веществ.

Задача решается тем, что в известном способе отбора штаммов микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов путем выделения микроорганизмов из различных источников и последующей оценки их биологических свойств, отличающийся тем, что в качестве критерия отбора используют способность данных микроорганизмов предупреждать нарушения минерального обмена со стороны макроорганизма, перорально получающего подобные пробиотические препараты.

Для проведения исследований формируется необходимое количество опытных и контрольных групп лабораторных животных, идентичных по половому и возрастному составу, а также весу, и в предшествующий опыту период находившихся в условиях сбалансированного питания в соответствии с рекомендациями НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифософского (Порядков Л.Ф. Базовые модели для изучения проблем искусственного питания в эксперименте. М.: НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифософского, 2001. - С.103-131).

В ходе эксперимента сравнивали влияние на минеральный обмен двух препаратов пробиотиков: бифидумбактерина (штамм Bifidobacterium longum) и споробактерина (штамм Baccillus subtilis 534).

Исследования выполнены на 4 группах 11-месячных крыс-самцов, находившихся в предшествующий опыту период в условиях сбалансированного питания по рекомендациям НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифософского.

В ходе эксперимента подопытные животные I контрольной группы также содержались на сбалансированном рационе (полнорационный комбикорм), особи II контрольной и I, II опытных групп находились на дефицитной по минералам диете, что достигалось через выпойку дистиллированной водой и скармливание приготовленного особым способом риса (варка полированного риса в течение 15 минут с последующим удалением отвара и промывкой дистиллированной водой). С целью профилактики авитаминозных состояний у крыс в опытный рацион вводили поливитаминный комплекс, содержавший витамины A, D, С, К, Е, В₁, В₂, В₃, В ₄, В₅, В₆, B_с, B₁₂ .

В эти же сроки крысы I и II опытных групп перорально получали препараты пробиотиков - соответственно бифидумбактерин (в дозировке 0,3 млн. мкрб. тел/кг живой массы) или споробактерин (в дозировке 50 млн. мкрб. тел/кг).

По истечении учетного периода проводился убой лабораторных животных с последующим извлечением трубчатых костей и определением в них общего содержания микроэлементов, а также установления предельной силы сжатия с использованием "Прибора испытания на сжатие и растяжение" (ЗиП, модель МИП 100-2 №26).

В ходе исследования было установлено, что различные пробиотические препараты оказывают неоднозначное влияние на величину эндогенных потерь минеральных элементов (таблица).

В частности, бифидумбактерин демонстрировал способность к сведению к минимуму потерь минеральных веществ из организма крыс I опытной группы. Так, при оценке предельной силы сжатия трубчатых костей подопытных животных на сжатие особи на фоне минералдефицитной диеты, получавшие препарат Bifidobacterium longum, характеризовались интегральным показателем силы сжатия трубчатых костей = 19,7 Н, что на 19,4% (Р<0,05) превосходило аналогичный показатель во II контрольной группе и достоверно не отличалось от такового у крыс I контрольной группы, содержавшихся на сбалансированном пищевом рационе.

В противоположность этому крысы II опытной группы на фоне минералдефицитной диеты, получавшие пробиотик споробактерин, характеризовались наименьшими значениями предельной силы сжатия трубчатых костей (15,2 Н), которые на 18,7% (Р<0,05) уступали таковым в I контрольной группе и оказывались даже ниже, чем у особей II контрольной группы.

Показатели исследований трубчатых костей.

Измеряемые		Группы
показатели		I контроль	II контроль	I опытная	II опытная
сила	min	12,0	10,0	12,0	9,00
сжатия, н.	max	26,0	21,0	30,0	21,67
М±m		18,7±2,86	16,5±0,5	19,7±0,78	15,2±0,6

Таким образом, Bifidobacterium longum, являющийся одним из основных компонентов нормального кишечного микробиоценоза, способен свести к минимуму эндогенные потери минеральных веществ из организма крыс, что может объясняться влиянием данного микроорганизма на значения внутрикишечного рН и определяемую этим степень растворимости двух- и трехвалентных катионов.

Указанная особенность выгодно отличает его от другого пробиотического штамма - Baccillus subtilis, не препятствующего или даже усиливающего эндогенные потери минеральных элементов. Последнее в какой-то степени может объясняться способностью бактерий рода Bacillus к инкорпорации и к последующему выведению из макроорганизма некоторых химических соединений или эссенциальных элементов (Журнал Сельскохозяйственная биология / Проблема слабости конечностей у цыплят мясных кроссов. Фисинин В.И., Байковская Е.Ю. - №6, 1995 г.).

Таким образом, вся совокупность полученных данных позволяет с новых позиций взглянуть на роль нормальной микрофлоры в минеральном обмене, а также констатировать неоднозначный характер подобного воздействия, заключающийся как в предупреждении эндогенных потерь минеральных веществ, так и в возможном усилении данных неблагоприятных последствий. В этой связи перспективной также представляется разработка нового поколения пробиотических препаратов, содержащих специально отобранные живые бактериальные культуры, способные предупреждать или корректировать минеральный дисбаланс в организме животных и человека, возникающий в результате воздействия неблагоприятных внешних факторов или старения.

Протективное действие бифидобактерий в отношении всасывания минеральных веществ проиллюстрировано результатами исследований цыплят-бройлеров кросса "Смена". В ходе эксперимента на фоне повышенной энергии роста подопытной птицы, обусловленной значительным содержанием протеина (21-23%) и доступной для обмена энергии (13,3 МДж/кг) в условиях дисбаланса по отношению кальций/доступный фосфор (удельная масса кальция - 0,9%, доступного фосфора - 0,55%), дача цыплятам препарата бифидумбактерина (штамм Bifidobacterium longum) сопровождалась снижением числа аномалий ног (в том числе, случаев дисхондроплазии) по сравнению с контролем на 7,25%, а сохранность поголовья повышалась на 6,7%. Кроме того, независимо от повышения интенсивности роста опытных особей пробиотик-содержащая диета способствовала увеличению массовой доли кальция в большеберцовой кости 7,7% по сравнению с контролем.

В качестве препарата, корректирующего процесс обмена кальция и, таким образом, предупреждающего развитие остеопороза, был использован кисломолочный продукт на основе живого пробиотического штамма B.longum. Назначение продукта в количестве по 200 мл один раз в день в течение 6 месяцев проводилось 48 пациентам в возрасте 65-83 лет, проживающих в доме-интернате для престарелых и инвалидов. Контрольную группу составили 52 пациента того же возрастно-полового состава, проживающие в другом отделении данного учреждения и не имеющие отличий от первой группы по количественному и качественному составу рациона питания, а также характеризующиеся сходной двигательной активностью.

Состояние костной ткани обследуемых оценивалось двукратно (до начала применения кисломолочного продукта и после его завершения) по результатам ультразвуковой денситометрии пяточной кости, а также на основе данных о статистике травматизма на примере переломов шейки бедра.

При проведении подобных исследований через 6 месяцев приема кисломолочного продукта в первой группе по данным ультразвуковой денситометрии было установлено снижение расчетной величины относительного риска перелома RRF (Relative Risk of Fracture) на 7,3% по сравнению с исходными значениями и на 9,1% по сравнению со второй (контрольной) группой, не получавшей кисломолочного продукта. Сходными результатами характеризовались изменения еще одного расчетного параметра - физиологического возраста кости РАВ (Psysiological Age of Bone) - соответственно -5,3% и -7,7% по сравнению с исходными значениями и контрольной группой. Зарегистрированные положительные сдвиги в структуре костной ткани подтвердились статистикой травматизма: в период приема продукта в первой группе был зарегистрирован только один случай перелома шейки бедра, а в последующие 6 месяцев после окончания приема продукта - ни одного случая; в то же время во второй группе аналогичные значения составили 2 и 3 случая соответственно.

Таким образом, прием кисломолочного продукта на основе живого пробиотического штамма B.longum позволил достичь замедления или прекращения потери костной массы лиц группы риска по развитию остеопороза.