фармацевтическая композиция для регенерации цирротической печени

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для регенерации тканей печени при лечении цирроза печени, содержащая эффективное количество 5-(2-пиразинил)-4-метил-1,2-дитиол-3-тиона (олтипраза) и фармацевтически приемлемый наполнитель, индуцирующая превращение недифференцированных стволовых клеток печени в нормальные клетки печени.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где эта композиция приготовлена в форме, выбранной из группы, состоящей из капсулы, таблетки, мягкой капсулы, суспензии, сиропа, инъекционного раствора и порошка.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где эта композиция приготовлена в форме для перорального введения.

4. Применение 5-(2-пиразинил)-4-метил-1,2-дитиол-3-тиона для приготовления лекарственного средства для лечения циррозной печени посредством регенерации тканей печени путем индукции превращения недифференцированных стволовых клеток печени в нормальные клетки печени.

5. Способ лечения млекопитающего, имеющего циррозную печень, посредством регенерации ткани печени путем индукции превращения недифференцированных стволовых клеток печени в нормальные клетки печени, включающий введение млекопитающему эффективного количества 5-(2-пиразинил)-4-метил-1,2-дитиол-3-тиона (олтипраза).

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции для регенерации тканей печени в пациентах, страдающих от цирротической печени, и применению этой композиции в качестве регенеративного агента тканей цирротической печени.

Уровень техники

Печень играет ключевую роль в метаболизме ксенобиотиков и в метаболизме эндогенных веществ. Печень является важным органом, в котором происходят постоянные ферментативные реакции и энергетический метаболизм. Среди многих хронических заболеваний в Корее, гепатит, цирроз и рак печени являются наиболее широко распространенными и угрожающими жизни заболеваниями после сердечнососудистых заболеваний. В частности, хронический алкоголизм и пьянство вызывают высокую вероятность повреждения печени. Хроническое повреждение печени, происходящее от вирусной инфекции или потребления алкоголя, является часто причиной цирроза или фиброза печени.

Цирроз является хроническим заболеванием печени с высоким коэффициентом смертности, и подобные состояния влекут за собой деструкцию паренхимных клеток и накопление соединительных тканей. Цирроз считается наиболее повреждающим среди инфекций печени и других хронических заболеваний печени. Цирроз возникает, когда клетки поврежденной печени не восстанавливаются обратно до нормальных клеток, а превращаются в фиброзные ткани, такие как коллаген, и паренхимные клетки печени разрушаются, приводя к деградации функции и уменьшению размера печени. Поскольку цирроз может вызывать смерть людей, существует высокая потребность в развитии подходящих терапевтических и превентивных лекарственных средств. Однако не существует известных лекарственных средств, которые регенерируют клетки печени, для лечения цирроза.

Различные вещества, в том числе несколько синтетических соединений и галеновых препаратов, обнаруживают гепатопротективные функции как in vitro, так и in vivo. Хотя известно, что силимарин и бетаин имеют гепатопротективные действия как результат ингибирования цитокинов или увеличения уровня глутатиона, эффекты, вызываемые ими, являются низкими, и, следовательно, трудно получить целебный успех.

Известно, что несколько заместителей серусодержащего дитиолтиона, обнаруживаемого природно в овощах, относящихся к семейству крестоцветных, обладают защищающими печень действиями. Среди них олтипраз, представленный химической формулой 1, использовали в ранних 1980-х годах в качестве лечебного агента против шистосомоза.

Химическая формула 1

Олтипраз увеличивает клеточное содержание тиолов и индуцирует экспрессию ферментов, ответственных за поддержание пула глутатиона (GSH) и детоксикацию ткани от электрофильных молекул. Активности следующих ферментов увеличиваются олтипразом: НАД(Ф)Н-хинонредуктазы, микросомной эпоксидгидролазы, глутатион-S-трансферазы (GST) и УДФ-глюкуронилтрансферазы (UDP-GT). В частности, GST защищает печень от тетрахлорида углерода и ацетаминофена (Ansher SS, Dolan P and Bueding E. Chemoprotective effects of two dithiolthiones and of butylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophen toxity. 1983, Hepatology 3, 932-935).

Кроме того, ольтпраз ингибирует химический канцерогенез, вызываемый бензо[а]пиреном, NDEA, и урацил-ипритом, а также индуцируемый афлатоксином В1 онкогенез печени и индуцируемый азоксиметаном канцерогенез ободочной кишки (Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD and Kensler TW. Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis. 1993, Cancer Res. 53, 3499-3504).

Известными ингибиторными механизмами канцерогенеза, используемыми олтипразом, являются следующие механизмы. Во-первых, олтипраз увеличивает уровень восстановленного GSH, антиоксиданта, в тканях. Во-вторых, он ингибирует биоактивацию канцерогенеза ингибированием ферментов фазы I, таких как цитохром Р450. В-третьих, он стимулирует детоксикацию канцерогенов индукцией ферментов детоксикации фазы II, в том числе GST и UDP-GT. В-четвертых, олтипраз ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа I in vitro. В пятых, он удаляет реакционноспособные промежуточные продукты в клетках посредством увеличения уровней тиолов и способствует репарации ДНК. Сообщалось, что олтипраз увеличивает уровни GSH в большинстве тканей и удаляет свободные радикалы, генерируемые радиацией или ксенобиотиками. Было известно также, что олтипраз действует в качестве защитного агента против радиации, способствуя поддержанию клеточного гомеостаза.

Проводились клинические испытания химиопрофилактического действия олтипраза против канцерогенеза печени. Эти результаты показали, что олтипраз является слабо активным в супрессии канцерогенеза печени и что олтипраз защищает печень против индуцируемой токсичным агентом гепатотоксичности, по меньшей мере умеренно. Кроме того, безопасность олтипраза была доказана в испытаниях токсичности, выполненных на крысах и собаках (Fund. Appl. Toxicol. 1997 Jan; 35(1):9-21).

Однако еще не было сообщений о химической композиции, эффективной в регенерации клеток печени в случае цирроза. Таким образом, с учетом биологической функции и важности печени в теле человека необходимо развитие лекарственных средств, которые имеют успешные целебные действия в лечении цирроза.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, которая является эффективной в регенерации тканей печени в случае цирротической печени. В одном аспекте данное изобретение обеспечивает композицию для регенерации тканей печени в случае цирротической печени, которая содержит 5-(2-пиразинил)-4-метил-1,2-дитиол-3-тион (олтипраз) в качестве активного ингредиента.

Краткое описание фигур

Признаки и преимущества данного изобретения станут более очевидными в результате подробного описания примеров вариантов данного изобретения со ссылкой на прилагаемые фигуры, в которых:

Фиг.1 является диаграммой в виде столбцов, показывающей увеличение коэффициента выживаемости цирротических крыс, которым был введен олтипраз.

Фиг.2 является фотографией тканей печени цирротической крысы и тканей печени после введения олтипраза и окрашивания трихромным красителем Мейссона.

Фиг.3А является диаграммой в виде столбцов, показывающей уменьшение асцитов в цирротических крысах после введения олтипраза.

Фиг.3B является диаграммой в виде столбцов, показывающей увеличение альбумина плазмы в цирротических крысах после введения олтипраза.

Фиг.4А представляет диаграммы в виде столбцов, показывающие увеличение массы печени в цирротических крысах после введения олтипраза.

Фиг.4B представляет фотографии, показывающие, что деление клеток печени активируются введением олтипраза в цирротических крыс.

Фиг.5A представляет фотографии деления и регенерации клеток печени введением олтипраза в цирротических крыс после окрашивания PCNA (маркера пролиферации клеток).

Фиг.5B представляет фотографии, показывающие стимуляцию недифференцированных стволовых клеток в дифференцированные стволовые клетки вследствие введения олтипраза в ткань цирротической печени (Верхняя часть: окрашивание Thy1.1, нижняя часть: окрашивание Flt-3).

Фиг.6А является фотографией гель-электрофореза, показывающего увеличение экспрессии c-Met вследствие введения олтипраза в цирротических крыс.

Фиг.6B является фотографией гель-электрофореза, показывающего увеличение LAP, который является активным агентом С/ЕВР- , и уменьшение LIP, который является ингибиторньм фактором, и восстановление экспрессии С/ЕВР- в цирротических крысах после введения олтипраза.

Фиг.7А является фотографией гель-электрофореза, показывающего постепенное увеличение количества С/ЕВР- в ядерной фракции клеток после инкубирования гепатоцитов с олтипразом.

Фиг.7B представляет иммуноцитохимические фотографии, показывающие перемещение С/ЕВР- в ядро клетки при инкубировании гепатоцитов с олтипразом.

Осуществление изобретения

На основании того факта, что для лечения в конечном счете цирроза необходимо не только ингибировать прогрессирование цирроза, но и добиться восстановления и регенерации поврежденных тканей, авторы данного изобретения попытались разработать фармацевтическую композицию, которая имеет мало побочных эффектов и эффективно регенерирует ткани цирротической печени, и обнаружили, что олтипраз является эффективным в регенерации тканей цирротической печени.

Регенеративная способность олтипраза для тканей печени была продемонстрирована экспериментальными результатами данного изобретения.

В данном изобретении лечебное и регенеративное действия олтипраза в коррекции цирроза и фиброза тканей печени наблюдали в модельных крысах, которым вводили диметилнитрозамин (DMN) в течение 4 недель для индукции цирроза или фиброза печени. Эти результаты показали, что, хотя перед введением олтипраза коэффициент выживаемости крыс постепенно уменьшался, после введения имело место статистически значимое улучшение коэффициента выживаемости крыс. Кроме того, в сравнении с увеличенной активностью аспартатаминотрансферазы (AST) в плазме крови цирротических крыс кровь плазмы после введения олтипраза показала ослабленную AST-активность.

Содержание альбумина в плазме крови является репрезентативным показателем состояния печени, а альбумин необходим для регуляции осмотического давления плазмы крови. Олтипраз в крысах с цирротической печенью значимо восстанавливал пониженный уровень альбумина до нормального уровня и, кроме того, нормализовал осмотическое давление плазмы крови, уменьшая тем самым асциты, сопровождаемые циррозом печени.

Согласно количеству баллов фиброза и количеству баллов по шкале Кноделля, полученных гистопатологическими микроскопическими исследованиями цирротической печени, наблюдали большое количество волокон, накапливаемых вблизи воротных вен и воспаленных зон. Однако после введения олтипраза такие повреждения печени заметно ослаблялись.

Наряду с вышеописанными эффектами, введение олтипраза увеличивало массу печени, которая была ранее атрофирована вследствие цирроза. Гистопатологическое микроскопическое исследование показало частые деления клеток печени в цирротической печени. Кроме того, посредством исследования ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), который в норме появляется только во время периода клеточного роста, под микроскопом после иммунохимического окрашивания клеток крысы, которым вводили олтипраз, показали значительное увеличение количества клеток печени с PCNA. Такое увеличение экспрессии PCNA было подтверждено Вестерн-блот-анализом.

Далее, экспрессия других белков, связанных с пролиферацией клеток печени, таких как c-Met, рецептор фактора роста клеток печени и ССААТ/энхансерсвязывающий белок (С/ЕВР- ), накапливаемый печенью активирующий белок (LAP), уменьшалась в цирротических крысах, но увеличивалась в крысах, которым вводили олтипраз. С другой стороны, экспрессия укороченной изоформы С/ЕВР- , накапливаемого печенью ингибиторного белка (LIP), уменьшалась введением олтипраза.

При окрашивании недифференцированных стволовых клеток печени цирротические крысы обнаружили многочисленные стволовые клетки. Однако крысы, которым вводили олтипраз, показали значительное уменьшение стволовых клеток в печени. Такой результат подтверждает вывод о том, что олтипраз индуцирует недифференцированные стволовые клетки к превращению в дифференцированные клетки печени.

Таким образом, терапевтическое действие олтипраза, активного ингредиента композиции в данном изобретении, получают вследствие его способности регенерировать ткани через усиленное клеточное деление и усиленную пролиферацию клеток.

При приготовлении фармацевтической композиции данного изобретения для фактического применения готовят унифицированные (стандартные) дозированные формы для перорального введения, инъекционные растворы и т.п. и вводят их в соответствии с общепринятым способом, заимствованным из соответствующей области фармацевтики.

Подходящий пероральный препарат включает в себя твердую или мягкую капсулу, таблетку, порошок, сироп и т.д. Пероральная форма, кроме олтипраза в качестве фармацевтически активного агента, может содержать один или несколько фармацевтически неактивных носителей. Например, пероральная форма может содержать наполнители, такие как крахмал, лактоза, карбоксиметилцеллюлоза и каолин; связывающие вещества, такие как вода, желатин, спирт, глюкоза, аравийская камедь и трагакантовая камедь; дезинтеграторы, такие как крахмал, декстрин и альгинат натрия; и смазывающие вещества, такие как стеариновая кислота, стеарат магния и жидкий парафин.

Суточная доза фармацевтической композиции согласно данному изобретению зависит от различных факторов, таких как степень цирроза печени пациента, время появления заболевания, возраст, здоровье, другие осложнения и т.д. Однако для среднего взрослого олтипраз вводят один или два раза в день с получением общей суточной дозы 10-1000 мг, более предпочтительно 50-300 мг. Однако, в случаях, когда пациент имеет тяжелый цирроз печени, данное изобретение может идти далее этого диапазона фармацевтической композиции и использовать даже еще более высокие дозы.

В приведенных ниже примерах данное изобретение объясняется более подробно. Однако данное изобретение не ограничивается этими примерами.

ПРИМЕРЫ

Крыс Sprague-Dawley, в возрасте 6 недель, с массой 140-160 г, использовали в приведенных ниже примерах.

Пример 1 - Коэффициенты выживаемости крыс с циррозом

Посредством непрерывного введения крысам диметилнитрозамина (DMN) 3 раза в неделю в течение 4 недель получали тест-модели цирротических печеней. В этой временной точке крыс, обнаруживающих только признаки фиброза печени, помещали в группу, отдельную от крыс, обнаруживающих признаки цирроза, и коэффициенты выживаемости крыс с циррозом и крыс с фиброзом печени исследовали в течение следующих 4 недель.

Коэффициент выживаемости тест-моделей с цирротической печенью постепенно снижался с прохождением времени и после 4 недель коэффициент выживаемости был около 48%. Степень выживаемости крыс, которым вводили 30 мг/кг олтипраза 3 раза в неделю в течение 4 недель, увеличивался до 83%, показывая статистически значимое улучшение. Далее, не наблюдали смерти крыс с фиброзом печени, после того как этим крысам вводили 30 мг/кг олтипраза 3 раза в неделю.

Пример 2 - Ослабление цирроза печени согласно исследованию проб ткани

Исследовали гистопатологическое действие олтипраза на цирроз. Ткань печени цирротических крыс показала значительное количество волокон, накапливаемых вокруг кровеносного сосуда, образующих цирротические узелки как результат этого накопления. При введении цирротическим крысам 15-30 мг/кг олтипраза, 3 раза в неделю в течение 4 недель, накопление волокон уменьшалось зависимым от дозы образом.

Лечебное действие олтипраза на цирроз печени определяли гистопатологически через количество баллов фиброза, получаемых после трихромного окрашивания по Мейссону, и посредством баллов по шкале Кноделля, которые показывают воспаление воротных вен и степень фиброза печени (фиг.2, таблица 1). Эти результаты показывают эффективное лечение цирроза при введении 15 или 30 мг/кг олтипраза.

На фиг.2 А является фотографией ткани печени здоровой крысы, В является фотографией ткани печени из группы, имеющей цирроз, С является фотографией ткани печени из группы, имеющей цирроз, которой вводили 15 мг/кг олтипраза, 3 раза в неделю в течение 4 недель, и D является фотографией ткани печени из группы, имеющей цирроз, которой вводили 30 мг/кг олтипраза, 3 раза в неделю в течение 4 недель.

Таблица 1
Действие олтипраза на цирроз
Группа	Баллы фиброза	Баллы Кноделля
Контроль	0	0
Группа с циррозом	3,8±0,2	14,0±0,8
Группа с циррозом + олтипраз 15 мг/кг	2,9±0,4	8,7±1,1**
Группа с циррозом + олтипраз 30 мг/кг	2,8±1,1*	6,8±2,5**
Группа с фиброзом	2,2±0,5а	6,0±1,2a
Группа с фиброзом + олтипраз 15 мг/кг	2,8±0,4	7,0±1,2
Группа с фиброзом + олтипраз 30 мг/кг	1,0±0,0**	2,6±0,4*

Каждая величина представлена средней величиной ± стандартное отклонение. Количество животных было 5-10. Значимость каждой группы определена с использованием парного t-критерия Стьюдента. Значимость показана *р<0,05, **р<0,01 в сравнении с крысами с циррозом или с фиброзом печени. Крысы с фиброзом печени имели более низкие баллы по шкале Кноделля, чем крысы с циррозом (а, р<0,05). Степень фиброза 0 = нормальные, 1 = присутствие слегка фиброзной ткани, 2 = присутствие умеренной фиброзной ткани, 3 = присутствие явной фиброзной ткани, 4 = наличие тяжелого фиброза. Сумма величин из образования волоконных мостиков около воротных вен (наивысший балл = 10), потери клеток внутри долей печени (наивысший балл = 4), воспаления воротной вены (наивысший балл = 4) и фиброза (наивысший балл = 4) дает балл по шкале Кноделля.

Пример 3 - Биохимические параметры крови животных с циррозом печени

В сравнении со здоровыми животными крысы с циррозом обнаруживали увеличенную активность аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST), в каждом случае в 3-4 раза. При введении крысам 15 мг/кг олтипраза, 3 раза в неделю в течение 4 недель, активность ALT и AST в плазме крови уменьшалась, и при введении 30 мг/кг наблюдали приблизительно 70% уменьшение величины AST, что свидетельствует о статистической значимости (таблица 2).

Количество билирубина в плазме крови является показателем функциональной активности печени. В результате введения олтипраза цирротическим крысам количество билирубина, производимого под действием цирроза, имеет тенденцию понижения. Общий уровень холестерина в плазме крови не показывал значительного изменения в цирротических крысах или в цирротических крысах, которым вводили олтипраз (таблица 2).

Таблица 2
ALT, AST, билирубин и холестерин в плазме крови
Группа	ALT	AST	Билирубин	Холестерин
Контроль	55±4	141±18	1,1±0,1	97±6
Группа с циррозом	138±14*	275±36*	2,7±0,8	152±30
Группа с циррозом + олтипраз 15 мг/кг	124±47	206±24	1,8±0.4	116±9
Группа с циррозом + олтипраз 30 мг/кг	110±39	185±22#	1,4±0,2	104±7

Каждая величина представлена средней величиной ± стандартное отклонение. Количество используемых животных было 8-11. Значимость каждой группы определена с использованием парного t-критерия Стьюдента. Значимость показана *р<0,05 в сравнении с контролем и ^#р<0,05 в сравнении с крысами с циррозом.

Пример 4 - Действие олтипраза на содержание альбумина в плазме и образование асцитов

Другим репрезентативным клиническим симптомом цирроза является накапливание асцитов. При исследовании образования асцитов в 10 вариантах цирротических крыс с использованием индекса образования асцитов 0 = нет видимых асцитов, 1 = присутствие небольшого количества асцитов между органами, 2 = значительный поток накапливаемых асцитов после разреза брюшной полости, обнаруживаемый невооруженным глазом, и 3 = значительное вытекание накапливаемых асцитов после разреза брюшной полости, эта величина составляла 1,7 для цирротических крыс. После введения 15 мг/кг и 30 мг/кг олтипраза эта величина падала до 0,9 и 0,4 соответственно (фиг.3). Значимость показана **р<0,01 в сравнении с контролем и ^#р<0,05 в сравнении с крысами с циррозом.

Асциты образуются, когда синтез белка плазмы крови (в частности, альбумина) уменьшается в тканях печени, что приводит к нарушению поддержания равновесия осмотического давления в крови. Количество альбумина в плазме крови цирротических крыс значительно уменьшается. Однако после введения 30 мг/кг олтипраза 3 раза в неделю в течение 4 недель восстанавливается нормальное содержание альбумина (фиг.3B). Значимость показана **р<0,01 в сравнении с контролем и ^#р<0,05 в сравнении с крысами с циррозом.

Пример 5 - Действие олтипраза на регенерацию ткани печени в цирротических крысах

Цирроз является ответственным не только за уменьшение функции печени, но также за атрофию тканей печени. При изучении веса печени 10 цирротических крыс этот вес уменьшался до приблизительно 56% веса нормальной печени. После введения 15 мг/кг и 30 мг/кг олтипраза 3 раза в неделю в течение 4 недель вес печени восстанавливался почти до нормальной веса (фиг.4А). С другой стороны, вес почки не обнаруживал значительного изменения (верхняя часть фиг.4А). Поскольку потеря веса сопутствует циррозу, для стандартизации результатов испытания использовали вес головного мозга, на которую обычно не влияет цирроз, в качестве сравнительного веса для получения изменений этого веса. Значимость показана **р<0,01 в сравнении с контролем и ^#р<0,05 в сравнении с крысами с циррозом.

После введения 30 мг/кг олтипраза цирротическим крысам 3 раза в неделю в течение 4 недель деление клеток печени наблюдали с использованием микроскопа (фиг.4B). Левая сторона фиг.4B является фотографией ткани печени, полученной после введения олтипраза цирротическим крысам, полученной после трихромного окрашивания Мейссона. Эта фотография ясно показывает делящиеся клетки, которые являются очень редкими в нормальных или цирротических тканях печени. Даже при использовании ядерного окрашивания красителем быстрым красным, который селективно окрашивает каждое ядро, делящиеся клетки и миграцию хромосом наблюдали в цирротических крысах, которым вводили олтипраз (правая сторона фиг.4B).

Способ иммунохимического окрашивания PCNA часто используют для тестирования пролиферации клеток в моделях животных. PCNA является стабильным ядерным белком клеточного цикла (36 кДа), который экспрессируется в поздней G1 и S фазах клеточного цикла и служит в качестве превосходного маркера для пролиферирующих клеток (Kawamura К, Kobayashi Y, Tanaka Т, Ikeda R, Fujikawa-Yamamoto К, Suzuki К. Intranuclear localization of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle in renal cell carcinoma. 2000 Anal Quant Cytol Hictol 22, 107-113).

Иммунохимический анализ PCNA выполняют со специфическим антителом против PCNA (Santa Cruz Biotech). Анализ проводят с использованием непрямого способа авидин-биотин-щелочная фосфатаза (InnoGenex). Парафинированные срезы тканей печени из контрольной, цирротической крысы и цирротической крысы, которой вводили 30 мг/кг олтипраза 3 раза в неделю в течение 4 недель, помещали на предметные стекла, парафин удаляли и срезы гидратировали при комнатной температуре. С использованием блокирующего агента предотвращали неспецифические связывания антитела. Затем в увлажненной камере эти срезы инкубировали с антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубирования для промывания предметных стекол использовали забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР) с 0,1% Твином-20. Предметные стекла подвергали действию биотинилированных вторичных антител и давали им реагировать в течение 5 минут при 37°С с последующей реакцией в течение 5 минут при 37°С с добавленной конъюгированной со стептавидином щелочной фосфатазой. Затем использовали 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) и краситель нитросиний тетразолий (NBT) в качестве субстрата фосфатазы для инкубирования со срезами на предметном стекле, пока не станут видимыми правильные окрашивания. После этого срезы опять окрашивали ядерным красителем быстрым красным.

Результат такого способа иммунохимического окрашивания PCNA показал, что контрольные животные не обнаруживали каких-либо клеток с PCNA, а цирротические крысы обнаруживали положительную реакцию на PCNA вблизи волокон кровеносных сосудов. В крысах, которым вводили олтипраз, клетки с PCNA наблюдали в больших количествах по всей тест-пробе. В сравнении с пробой из цирротической крысы без введения олтипраза встречаемость PCNA была приблизительно в два раза более частой в крысах, которым вводили олтипраз (фиг.5А).

Ядерные фракции печени из контрольных крыс, цирротических крыс и цирротических крыс, которым вводили олтипраз (30 мг/кг, 3 раза в неделю в течение 4 недель), растворяли в растворе для разведения, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН), для образования пробы и хранили при -70°С. После электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле проводили анализ иммуноблота. Пробу фракционировали с использованием 12% гель-электрофореза и электрически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали с поликлональным мышиным антителом против-PCNA - (1:1000) (Santa Cruz Biotech) и затем инкубировали опять с конъюгированным с пероксидазой вторичным антителом. Наконец, использовали набор для ECL-хемилюминесценции, изотовляемый компанией Amersham, для проявления полосы.

Даже при использовании вестерн-блот-анализа для исследования экспрессии PCNA было значительное увеличение экспрессии PCNA, как показано увеличением интенсивности полосы PCNA 36 кДа в тканях печени цирротических крыс, которым вводили олтипраз, в сравнении с контрольными крысами или цирротическими крысами без обработки.

Известно, что клетки, которые регенерируются в ткани печени, происходят из стволовых клеток. В данном изобретении Thy1.1 и Flt-3 (Santa Cruz Biotech), специфические маркерные белки стволовых клеток, окрашивали с использованием способа окрашивания, сходного со способом PCNA, для исследования распределения стволовых клеток во время цирроза. В цирротических крысах наблюдали многочисленные клетки, содержащие Thy1.1 и Flt-3, но такие клетки не наблюдали в контрольных крысах (фиг.5B). В цирротических крысах, которым вводили олтипраз (30 мг/кг, 3 раза в неделю в течение 4 недель), было существенное снижение количества клеток, содержащих Thy1.1 и Flt-3, в сравнении с цирротическими крысами без обработки. Считается, что такой результат является результатом действия олтипраза в превращении недифференцированных стволовых клеток в дифференцированные клетки печени.

Пример 6 - Действие олтипраза на экспрессию c-Met, ингибированную циррозом печени

c-Met является рецептором фактора роста гепатоцитов (HGF), используемым в пролиферации и дифференцировке клеток печени. Экспрессия c-Met снижается циррозом (фиг.6А). Когда c-Met не присутствует в подходящем количестве, даже в присутствии HGF, ткани печени не будут образовываться.

В цирротических крысах, которым вводили олтипраз (30 мг/кг, 3 раза в неделю в течение 4 недель), экспрессия c-Met была значительно более высокой, чем в крысах без введения олтипраза (фиг.6А). Такой результат согласуется с представлением, что олтипраз регенерирует ткани печени, которые были подвергнуты циррозу.

Пример 7 - Действие олтипраза на перемещение С/ЕВР в ядро

Важными факторами транскрипции, связанными с пролиферацией клеток печени, являются С/ЕВР- и С/ЕВР- , принадлежащие к С/ЕВР-семейству. Среди этих двух факторов С/ЕВР- считается более важным в пролиферации клеток печени. При удалении гена С/ЕВР- из мыши восстановление размера печени после частичной гепатэктомии значимо уменьшалось (Greenbaum LE, Li W, Cressman DE, Peng Y, Ciliberto G, Poli V, Taub R. CCAAT/enhancer-binding protein beta is required for normal hepatocyte proliferation in mice after partial hepactectomy. J.Clin Invest. (1998) 102:996-1007).

С учетом важности С/ЕВР в регуляции регенерации печени, исследовали экспрессию С/ЕВР- и С/ЕВР- в цирротических крысах, которым вводили олтипраз (30 мг/кг, 3 раза в неделю в течение 4 недель). После введения цирротической крысе 30 мг/кг олтипраза 3 раза в неделю в течение 4 недель появление накапливаемого в печени ингибиторного белка (LIP), который является изоформой С/ЕВР- и манифестация которого увеличивается в цирротических крысах, почти полностью исчезало. С/ЕВР- , хотя и манифестируется в контрольных крысах, является значительно пониженным в цирротической крысе. Однако после введения цирротической крысе 30 мг/кг олтипраза 3 раза в неделю в течение 4 дней экспрессия С/ЕВР- в значительной степени восстанавливается.

Поскольку в крысах, которым вводили олтипраз, обнаруживалась явная активность С/ЕВР, следующее испытание определяло количество С/ЕВР, перемещенного в ядро, в первичных культивируемых гепатоцитах с использованием вестерн-блот-способа для испытания прямого действия олтипраза на активность С/ЕВР в клетках печени. При инкубировании первичных культивируемых гепатоцитов с олтипразом в концентрации 30 мкМ количество С/ЕВР- и С/ЕВР- в ядре клеток печени постепенно увеличивается (фиг.7А). Однако при инкубировании гепатоцитов, выделенных из цирротических крыс, с олтипразом не наблюдали значимого изменения. Такой результат показал, что олтипраз непосредственно запускает активность С/ЕВР.

После этого для исследования, стимулирует ли олтипраз перемещение С/ЕВР- в ядро, гепатоциты крыс инкубировали с олтипразом в концентрации 30 мкМ в течение 6 часов. Согласно иммуногистохимическому анализу олтипраз явно стимулировал перемещение С/ЕВР- в ядро (фиг.7B).

Таким образом, регенерация тканей печени олтипразом сопровождается активацией С/ЕВР.

Как показано в предыдущем описании, олтипраз может эффективно регенерировать ткани цирротической печени, и фармацевтическая композиция данного изобретения является высокоэффективной в регенерации тканей печени, подвергнутой циррозу, и лечении цирротической печени.

Пример приготовления 1

Олтипраз	25 мг
Лактоза	50 мг
Крахмал	10 мг
Стеарат магния	Подходящее количество

Указанные выше компоненты смешивают и готовят таблетку обычным способом приготовления таблеток.

Пример приготовления 2

Олтипраз	100 мг
Лактоза	50 мг
Крахмал	10 мг
Стеарат магния	Подходящее количество

Указанные выше компоненты смешивают и готовят таблетку обычным способом приготовления таблеток.

Пример приготовления 3

Олтипраз	250 мг
Лактоза	50 мг
Крахмал	10 мг
Стеарат магния	Подходящее количество

Указанные выше компоненты смешивают и готовят таблетку обычным способом приготовления таблеток.

Пример приготовления 4

Олтипраз	25 мг
Лактоза	30 мг
Крахмал	28 мг
Тальк	2 мг
Стеарат магния	Подходящее количество

Указанные выше компоненты смешивают и готовят твердую желатиновую капсулу обычным способом приготовления твердых желатиновых капсул.

Пример приготовления 5

Олтипраз	100 мг
Лактоза	30 мг
Крахмал	28 мг
Тальк	2 мг
Стеарат магния	Подходящее количество

Указанные выше компоненты смешивают и готовят твердую желатиновую капсулу обычным способом приготовления твердых желатиновых капсул.

Пример приготовления 6

Олтипраз	250 мг
Изомеризованный сахар	10 мг
Сахар	30 мг
Натрий-КМЦ	100 мг
Лимонный ароматизатор	Подходящее количество

(добавить дистиллированную воду до общего объема 100 мл)

Готовят суспензию из указанных выше компонентов в соответствии с общепринятыми способами приготовления суспензий. Коричневый флакон на 100 мл заполняют этой суспензией и стерилизуют.

Пример приготовления 7

Олтипраз	500 мг
Изомеризованный сахар	20 мг
Сахар	20 мг
Аргинат натрия	100 мг
Апельсиновый ароматизатор	Подходящее количество

(добавить дистиллированную воду до общего объема 100 мл)

Готовят суспензию из указанных выше компонентов в соответствии с общепринятыми способами приготовления суспензий. Коричневый флакон на 100 мл заполняют этой суспензией и стерилизуют.

Пример приготовления 8

Олтипраз	250 мг
Лактоза	30 мг
Крахмал	20 мг
Стеарат магния	Подходящее количество

Указанные выше компоненты смешивают и заполняют ими покрытый полиэтиленом конверт и запечатывают для получения порошка.

Пример приготовления 9

1 мягкая капсула, содержащая

Олтипраз	100 мг
Полиэтиленгликоль	400 мг
Концентрированный глицерин	55 мг
Дистиллированную воду	35 мг

Полиэтиленгликоль смешивают с концентрированным глицерином и затем добавляют дистиллированную воду. При поддержании смеси при 60°С к этой смеси добавляют олтипраз. Смесь перемешивают при приблизительно 1500 об/мин. После однородного смешивания этой смеси смесь охлаждают при комнатной температуре при медленном перемешивании. Пузырьки воздуха удаляют при помощи вакуумного насоса с оставлением содержимого этой мягкой капсулы.

Мембрану мягкой капсулы готовят в соответствии с общепринятыми способами приготовления с использованием широко известной смеси мягкий желатин-пластификатор, содержащей 132 мг желатина, 52 мг концентрированного глицерина, 6 мг на капсулу 70% раствора дисорбита, подходящее количество ароматизатора этилванилина и воск карнаубы в качестве агента покрытия.

Промышленная применимость

Фармацевтическая композиция, содержащая олтипраз, представленная в данном изобретении, является клинически применимой в стимуляции регенерации тканей печени в случае цирротической печени, и эта композиция проявляет эффективное лечение цирроза.