способ получения олигосахаридов хитозана

Формула изобретения

Способ получения олигосахаридов хитозана, включающий ферментативный гидролиз хитозана в водном растворе, содержащем уксусную кислоту, с последующей фильтрацией гидролизата и сушкой, отличающийся тем, что для проведения ферментного гидролиза используют хитозаназу, полученный гидролизат после фильтрации перед сушкой подвергают удалению уксусной кислоты посредством анионообменной очистки с использованием сильноосновной анионообменной смолы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к способу получения олигосахаридов хитозана для лечения гипертонии.

Хитозан представляет собой полимер биологического происхождения. С химической точки зрения хитозан представляет собой деацетилированный обычно более 70% хитин (поли-2-ацетамидо-2-дезокси-Д-глюкоза).

Хитозаны как обычные полисахариды деполимеризуются различными методами, в частности ферментативной олигомеризацией в присутствии соляной, уксусной, аскорбиновой кислот. Korean Patent 142373 от 31 марта 1998 г.

Поскольку олигосахариды играют роль анионообменных материалов, полученные в этом случае продукты являются хлоридами, ацетатами, аскорбатами олигосахарида хитозана, образуемыми из среды кислоты, используемой для создания необходимого рН ферментативной деполимеризации.

Наличие в полученных олигосахаридах ионосвязанной соляной и уксусной кислоты приводит лишь к дополнительной нагрузке на организм, сказывается на работе желудка, кроме того, наличие избыточных количеств аскорбиновой кислоты в определенных случаях нежелательно.

Известен способ получения олигосахаридов хитозана с низким содержанием уксусной кислоты для последующего использования полученного продукта для создания различных ионосвязанных производных олигосахаридов хитозана. Патент RU 2232775 С1, приоритет 16.05.2003. Опубликован 20.07.2004, Бюл. №20.

Для получения олигосахаридов хитозана с низким содержанием уксусной кислоты полученный деполимеризацией хитозана в присутствии папаина в водном растворе уксусной кислоте и высушенный на распылительной сушилке продукт дважды подвергают попеременно двухкратному растворению в воде и распылительной сушке, в результате чего удается снизить количество ионосвязанной уксусной кислоты до 5,9 мас.%, что соответствует 16,82% аминогрупп, связанных уксусной кислотой.

Предложенный в патенте метод имеет высокие энергозатраты, значительные потери продукта при неоднократном прохождении через сушилку, кроме того, в этом случае не удается полностью исключить наличие уксусной кислоты в полученных олигосахаридах хитозана (ниже 5,9 мас.%), что соответствует 16,82% аминогрупп, связанных уксусной кислотой.

Задачей изобретения является создание нового эффективного способа получения олигосахаридов хитозана, не имеющих ионосвязанную кислоту (олигосахарид основание).

Сущность изобретения состоит в получении олигосахаридов хитозана ферментативной деполимеризацией в присутствии уксусной кислоты с последующей фильтрацией и распылительной сушкой продукта.

Отличие изобретения заключается в том, что после ферментативной деполимеризации полученный продукт перед сушкой проходит анионообменную очистку от уксусной кислоты.

Предлагаемый способ получения олигосахаридов хитозана не известен.

Нижеследующие примеры поясняют настоящее изобретение.

Пример 1

Хитозан со степенью деацетилирования 98% и исходной вязкостью 36 сП (1% р-р хитозана в 1% уксусной кислоте), полученный из крошки панциря краба путем последовательной деминерализации, депротенирования и деацетилирования (ТУ 9289-058-046893775-2001), используют для получения его 5% раствора в воде, содержащей 2,4% уксусной кислоты. Ферментативный гидролиз ведут в присутствии хитозаназы с активностью 250 ед/г (производство "Lyven" Франция), взятой в количестве 1,5 ед. хитозаназы к 1 г хитозана, при температуре 45°С в течение 30 минут. В реакционную емкость вновь добавляют хитозан до получения его общей концентрации в растворе в количестве 10 мас.% и вводят дополнительно хитозаназу в количестве 1,5 ед. к 1 г добавленного хитозана. Общее время ферментативной обработки 24 часа.

Полученный гидролизат фильтруют через полипропиленовый фильтр, имеющий отверстия 5 микрон.

В полученный гидролизат, содержащий олигосахариды хитозана, добавляют предварительно обработанную 0,1 N раствором NaOH в течение часа и затем промытую дистиллированной водой анионообменную смолу АВ-16 (сильноосновная СОЕ - 8,5 мг-экв/г) в количестве 150 г на 1 литр раствора.

Сорбция уксусной кислоты осуществляется в течение 1 часа при температуре 20°С при медленном перемешивании.

Полученный водный раствор олигосахаридов хитозана отделяют от анионообменной смолы путем фильтрации раствора через пористую хлопчатобумажную ткань. Анионообменную смолу промывают дистиллированной водой из расчета один объем дистиллированной воды на один объем анионообменной смолы. Промывную воду добавляют в водный раствор олигосахаридов хитозана.

Полученный водный раствор олигосахаридов хитозана сушат в распылительной сушилке PC-1,8 со скоростью подачи раствора 50 л/час, температура входящего горячего воздуха 160-170°С, а температура выходящего воздуха 60-70°С.

Полученные олигосахариды хитозана имеют вязкость 18 сП. Выход олигосахаридов 98 мас.%. Количество уксусной кислоты в полученном продукте 0,1% (определение методом обратного титрования).

Молекулярно-массовое распределение олигосахаридов хитозана определялось хроматографическим анализом на хромагрофической системе ВЭЖХ - система Bio-Rad XL. Элюент-фосфорный буфер (0,05 М, рН 3) с добавлением 0,5 М NaNO₃, скорость потока 1,1 мл/мин. Калибровка осуществлялась по декстранам ("Pharmacia Fine Chemicals") с известной массой в диапазоне 20-250 тыс. дальтон, а также по мальтоолигосахаридам ("Sigma") и глюкозе в области низких масс. Молекулярно-массовое распределение полученных олигосахаридов было получено в виде:

n1=0

n2-6=19%

n7-12=70%

n13-20=8%

n20-25=3%

n>25=0

Использованную анионообменную смолу АВ-16 заливают 0,1 N NaOH (жидкостной модуль 10), через час раствор сливают, смола дважды промывается дистиллированной водой (жидкостной модуль 20). Смола готова к повторному употреблению.

Пример 2.

Ферментативную деполимеризацию хитозана осуществляют в условиях примера 1.

Полученный гидролизат после фильтрации в условиях примера 1 пропускают через ионообменную колонку диаметром 20 см и рабочей высотой 2 метра, содержащую предварительно обработанную в течение 1 часа 0,1 NaOH (жидкостной модуль 20) и промытую дважды с тем же жидкостным модулем ионообменную смолу АВ-16 (СОЕ - 8,5 мг-экв/г, удельный объем после набухания 4 мл/г) в количестве 15,5 кг (в пересчете на сухую смолу).

Через колонку пропускают 75 литров гидролизата со скоростью подачи гидролизата в колонку 1 л/мин. Колонку промывают 15 литрами дистиллированной воды. Промывную воду добавляют в полученный раствор олигосахарида хитозана.

Сушку водного раствора олигосахарида хитозана осуществляют в условиях примера 1.

Полученные олигосахариды хитозана имеют вязкость 1,8 сП.

Выход олигосахаридов 97%.

Количество уксусной кислоты в полученном продукте 0,1 мас.%.

Молекулярно-массовое распределение олигосахаридов хитозана, определенное в условиях примера 1, идентично данным примера 1.

Ионообменная смола в колонке заливается 0,1% N раствором NaOH и выдерживается в течение 1 часа, после этого колонка промывается 60 л дистиллированной воды. Колонка готова к повторной операции.

Данные, подтверждающие клиническое применение полученного продукта.

Оценка эффективности олигосахаридов хитозана - "Олигосахарид основание" проводилась в Военно-медицинском институте ФПС РФ, Н.Новгород.

Как известно, сердечно-сосудистые заболевания и инсульт являются в настоящее время основной причиной смертности и инвалидности населения. Гипертоническая болезнь остается основным фактором риска развития инфаркта и инсульта.

Было проведено исследование влияния "Олигосахарида-основание" на восстановительный процесс лиц с гипертонической болезнью.

В исследовании было задействовано 60 человек, распределенных на две равные группы: контрольная, в которой использовался стандартный комплекс, и экспериментальная, в которой помимо стандартного комплекса применялся "Олигосахарид-основание".

Стандарт восстановительного комплекса включал ЛФК, массаж воротниковой зоны, йодобромную ванну, душ веерный, электросон, магнитолазеротерапию, медикаментозное лечение, сбалансированную диету, фитосбор «Успокоительный».

"Олигосахарид-основание" назначался по 1 капсуле (300 мг) 2 раза в день перед едой в течение 20 дней.

Оценка эффективности экспериментального и контрольного восстановительных комплексов производилась по следующим критериям: данные лабораторного исследования (САД, ДАД, ЧСС). Показатели регистрировались в первой, пятый, восьмой дни и в конце испытаний.

Снижение САД в контроле наблюдалось у 6,2%, в экспериментальной - 13,3%; ДАД в контроле снизилось у 10,8%, в опыте у 18,6%; урежение ЧСС в контроле у 32%, в опыте 75,6%.