способ получения биологически активного продукта гепатопротекторного действия

Формула изобретения

Способ получения биологически активного продукта, включающий культивирование гриба вида Fusarium sambucinum на питательной среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 48-72 ч с последующим отделением биомассы и получением культуральной жидкости, отличающийся тем, что для культивирования используют посевной материал, полученный путем предварительного выращивания гриба вида Fusarium sambucinum в присутствии этанола, а при культивировании в качестве фактора усиления продуцирования метаболитов гепатопротекторного действия в питательную среду добавляют 0,5-1,5 об.% этанола.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области пищевой промышленности и биотехнологии, а именно к способу получения биологически активного продукта из грибов, действие которого имеет гепатопротекторный характер.

Основными этиологическими факторами повреждения печени являются вирусные инфекции и токсические соединения. Наиболее распространенным токсическим соединением (токсином), разрушающим клетки печени, является этанол, потребление которого на душу населения увеличивается с каждым годом. Потребление этанола приводит к развитию алкогольного гепатита, фиброзу, циррозу печени и гепатоцеллюларной карциноме.

Известно большое количество препаратов гепатопротекторного назначения, полученных на основе химического синтеза, обладающих отрицательными побочными эффектами. В этом отношении выгодно отличаются средства природного происхождения и, в частности, полученные из мицелиальных грибов.

Например, в качестве гепатопротекторных препаратов «антиалкогольного» средства еще издревле использовали гриб Coprinus atramentarius, употребление которого не только приводило к стойкому отвращению к алкоголю, но из-за высокого содержания олеиновой кислоты (C_18:2) способствовало развитию гепатопротекторного эффекта.

Гепатопротекторным действием обладает биологически активная добавка (БАД) "Флоравит Э", содержащая метаболиты культуральной жидкости, продуцируемые мицелиальным грибом Fusarium sambucinum BKMF-3051D [1]. Способ получения этого, биологически активного продукта предусматривает культивирование гриба вида Fusarium sambucinum на питательной среде, содержащей источник углерода - 3-4%, азота - 0,2-0,3%, фосфора - 0,2-0,3% и микроэлементы - 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 48-72 часов, с последующим отделением биомассы и получением культуральной жидкости [2]. Этот известный способ получения биологически активного продукта выбран в качестве прототипа.

Однако полученный известным способом биологически активный продукт обладает недостаточно выраженным гепатопротекторным действием.

Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка нового способа приготовления биологически активного продукта из грибов вида Fusarium sambucinum, способствующего усилению гепатопротекторного действия.

Техническим результатом при реализации заявленного способа является получение нового биологически активного продукта - культуральной жидкости гриба, обогащенного биологически активными компонентами (метаболитами) и обладающего выраженным гепатопротекторным действием.

Этот результат достигается тем, что предлагается способ получения биологически активного продукта, включающий культивирование гриба вида Fusarium sambucinum на питательной среде, содержащей источник углерода - 3-4%, азота - 0,2-0,3%, фосфора - 0,2-0,3% и микроэлементы - 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 48-72 часов, с последующим отделением биомассы и получением культуральной жидкости. При этом перед культивированием подготавливают посевной материал путем предварительного выращивания гриба вида Fusarium sambucinum в присутствии этанола, а при культивировании в качестве фактора усиления продуцирования метаболитов гепатопротекторного действия в питательную среду добавляют 0,5-1,5 об.% этанола.

При приготовлении предложенного биологически активного продукта используются известные штаммы гриба вида Fusarium sambucinum (например, штаммы F.Sambucinum ВКМ F-3051Д, ВКМ F-26109Д, F-165Д-ВСБ-916 (PS-64), F-169Д-ВСБ-917, F-3052Д, F-8427Д, F-199Д-52587, F-676Д-139С и др.), депонированные Всесоюзной коллекцией микроорганизмов ИБФН АН СССР и Всесоюзной коллекцией промышленных микроорганизмов института «ВНИИгенетика».

Известно, что этиловый спирт является наименее пригодным источником углерода для питания грибов рода Fusarium, в частности при изучении влияния различных источников углерода на рост грибов вида Fusarium sambucinum этиловый спирт не использовался в качестве источника питания [3]. Авторами было обнаружено, что добавление в питательную среду 0,5-1,5 об.% этанола при культивировании гриба вида Fusarium sambucinum позволяет усилить продуцирование биологически активных компонентов (метаболитов), обладающих гепатопротекторным действием. Поскольку этанол оказывает ингибирующее действие на рост биомассы гриба [3], в качестве инокулята используют адаптированный к этанолу посевной материал. Для этого перед культивированием гриба подготавливают посевной материал путем предварительного выращивания гриба в присутствии этанола.

Представленные ниже примеры наглядно поясняют предложенный способ получения биологически активного продукта.

Пример 1.

Посевной материал готовят путем выращивания гриба - F.sambucinum на среде с 3,5° сусла в течение 3-4-х суток на качалке с 200-220 об/мин с получением макроконидий. В погруженной культуре гриб культивировали в колбах вместимостью 250 мл с 30 мл среды F на качалке с 220 об/мин при 27°С в течение 48 часов. Культивирование гриба на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, фосфора и микроэлементы, осуществляют в стерильных условиях с перемешиванием и аэрацией. Состав среды F, г/л: сахароза - 30; NaNOs - 3; К₂HPO ₄ - 1; MgSO₄ - 0,5; FeSO₄ - 0,01; KCl - 0,5; вода водопроводная. Для засева использовали 1 мл культуры с макроконидиями.

При культивировании в питательную среду вносили этанол в концентрации: 0,5 об.%; 1,0 об.%; 1,5 об.%; 2,0 об.%; 2,5%. Гриб выдерживал относительно высокое содержание алкоголя в среде. Однако внесение этанола в питательную среду в каждом случае оказывало отрицательное воздействие на рост биомассы. Ингибирование роста биомассы изменялось приблизительно по линейному закону и при содержании этанола 2,5 об.% выход биомассы достигал значения 2,3 раза меньше по сравнению с культивированием без добавления этанола.

Пример 2.

То же, что и в примере 1, но посевной материал готовят в присутствии этанола. Для этого при выращивании культуры F. sambucinum на среде с 3,5° сусла в течение 3-4-х суток на качалке с 200-220 об/мин добавляют 1% этанола с получением макроконидий. В погруженной культуре гриб выращивали в колбах вместимостью 250 мл с 30 мл среды F на качалке с 220 об/мин при 27°С в течение 48 часов. Культивирование гриба на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, фосфора и микроэлементы, осуществляют в стерильных условиях с перемешиванием и аэрацией. Состав среды F, г/л: сахароза - 30; NaNOs - 3; К₂HPO₄ - 1; MgSO₄ - 0,5; FeSO₄ - 0,01; KCl - 0,5; вода водопроводная. Для засева использовали 1 мл культуры с макроконидиями. При культивировании в питательную среду вносили этанол в концентрации: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 об.%. При внесении этанола в концентрации 0,5-1,5 об.% достигался наиболее оптимальный выход биомассы (минимальное ингибирование роста биомассы). Культивирование гриба вида Fusarium sambucinum на этаноле при использовании в качестве посевного материала макроконидий, выращенных в присутствии этанола (пример 2), значительно увеличивает выход биомассы по сравнению с выращиванием гриба Fusarium sambucinum на этаноле, но без добавления этанола при подготовке посевного материала (пример 1) - см. чертеж.

Следовательно, чтобы вырастить мицелий гриба, метаболизм которого осуществлялся бы в питательной среде включающей такой фактор ингибирования роста как этанол, необходимо использовать для засева предварительно адаптированный к этанолу посевной материал.

Культивирование мицелия, устойчивого к присутствию в питательной среде этанола, позволяет сделать вывод, что грибы активизируют продуцирование в питательную среду метаболитов - биологически активных соединений, которые в значительной мере могут оказывать нейтрализующие действие этанола ингибированию роста биомассы.

Как известно, грибы являются микроорганизмами эукариотами и, следовательно, культуральная жидкость, содержащая вышеуказанные метаболиты, будет обладать более выраженным гепатопротекторным действием.

После окончания культивирования отделяют биомассу и получают культуральную жидкость - конечный биологически активный продукт.

Биологически активный продукт может быть использован при приготовлении пищевых продуктов, а также в косметической промышленности, медицине и других областях в качестве источника биологически активных компонентов, обладающих выраженными гепатопротекторными свойствами.

Гепатопротекторное действие биологически активного продукта проверялось на крысах.

Пример 3.

Было сформировано пять групп животных. Контрольная группа получала обычный рацион сухих кормов. Вторая группа получала кроме корма этанол. Три группы получали дополнительно к этанолу биологически активную добавку - БАД 1, биологически активный продукт (БАП) 2, полученный заявленным способом, и БАП 3. Этанол получали по 3 мл 50% этанола (или по 10-12 мл на 1 кг веса). БАД 1-3 давали по 0,2 мл (или по 0,7-0,8 мл на 1 кг веса).

В качестве БАД 1 использовали БАД «Флоравит Э» [2], в качестве БАП 3 использовали аналогичный БАП, полученный в результате культивирования F. sambucinum по заявке [4].

Возможность нейтрализации развития острого алкогольного гепатита и отчетливого гепатопротекторного и кардиопротекторного эффектов проверялась с помощью сравнения биохимических анализов крови животных [5].

Величины относительного отклонения активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и активности аспартатаминотрансферазы (ACT) от контроля приведены в табл.1

табл.1
Группы животных, получающие дополнительно к кормам этанол и БАД	Этанол - группа 2	Этанол+БАД1 - группа 3	Этанол+БАП2 - группа 4	Этанол+БАП3 - группа 5
АЛТ трансфераза	0,358	0,002	- 0,048	0,00
ACT трансфераза	0,286	0,037	0,012	0,062

Сравнение биохимических анализов крови крыс из групп, получавших этанол, и контрольной группы показывает, что наиболее выраженным гепатопротекторным действием обладает БАП 2 - биологически активный продукт, представляющий собой культуральную жидкость, полученную в результате культивирования F. sambucinum в присутствии этанола.

Полученные данные свидетельствуют о возможности использования заявленного продукта и в качестве средства, обладающего также и кардиопротекторным действием.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить новый биологически активный продукт (культуральную жидкость), обогащенный биологически активными компонентами (метаболитами) и обладающий значительным гепатопротекторным действием.

Источники информации

1. «Биологически активная добавка «Флоравит Э» в гастроэнтерологии», Методические рекомендации для врачей, М.: Издание Российской медицинской академии последипломного образования, 2002 г.

2. «Биологически активная добавка к пище (варианты) и способ ее получения (варианты)» - RU 2177699 С1, 10.01.2002.

3. В.И.Билай. Фузарии. Киев-601, Из-во: «Наукова думка», 1977, с.240-241.

4. «Биологически активный пищевой продукт на основе молочного сырья (варианты)» - RU 2004116661 А, 10.11.2005.

5. «Экспериментальные исследования возможности нейтрализации развития острого алкогольного гепатита путем применения БАДов «Флоравит», полученных способом глубинного культивирования гриба Fusarium sambucinum». Отчет ОАО «ВНЦ БАВ», Москва, Купавна, 2005 г.