штамм бактерий gluconobacter oxydans-03 - продуцент бализа и способ получения бализа

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Gluconobacter oxydans-03 - продуцент бализа.

2. Способ получения бализа, включающий выращивание посевного материала из бактерий Gluconobacter oxydans в питательной среде с последующим внесением его в ферментационную питательную среду, состоящую из глюкозы, калия фосфорнокислого однозамещенного, аммония фосфорнокислого двузамещенного, жидкого дрожжевого автолизата, содержащего 350-500 мг % аминного азота, воды, проведение глубинной ферментации, отделение культуральной жидкости с последующей ионообменной очисткой, отличающийся тем, что для посевного материала используют штамм Gluconobacter oxydans-03, вносят посевной материал в количестве 0,75% по объему от ферментационной среды, в которой 1,5-2% жидкого дрожжевого автолизата, глубинную ферментацию ведут в течение 30-36 ч и отделяют культуральную жидкость от бактериальных клеток бентонитом, которого берут не менее 0,6% от объема культуральной жидкости.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ионообменную очистку проводят на анионите АВ-17-8 чс в форме и катионите Ку-2-8 чс в Н⁺ форме.

4. Способ по любому из пп.2 и 3, отличающийся тем, что ферментационная питательная среда содержит от объема 4% глюкозы, 0,01% калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,005% аммония фосфорнокислого двузамещенного и 1,5-2,0% жидкого дрожжевого автолизата с содержанием 350-500 мг% аминного азота.

5. Способ по любому из пп.2 и 3, отличающийся тем, что питательная среда для посевного материала содержит, г/л: маннита - 25, пептона - 3, жидкого дрожжевого автолизата с содержанием 350-500 мг% аминного азота - 50, вода - остальное.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности производству бализа, применяемого в медицине и ветеринарии. Бализ используется для изготовления: суппозиторий «Бализ» (патент РФ №2076696, МПК (6) А 61 К 9/02, 31/71, 1993), противовоспалительной ранозаживляющей мази для лечения мастита (патент РФ №2187302, МПК (7) А 61 К 31/00, 35/78, 9/06, А 61 Р 17/02, 2000), крема для кожи и лица (патент РФ №2137467, МПК (6) А 61 К 7/48, 1997), средства по уходу за волосами Аштен (патент РФ №2101004, МПК (6) А 61 К 7/06, 1995). Бализ представляет собой сумму глюконовых кислот: глюконовую, 2,5-дикетоглюконовую, 5-кетоглюконовую, 2-кетоглюконовую и коменовую кислоты.

Известны штаммы бактерий: Gluconobacter oxydans-01 - продуцент бализа (всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов В-2380). Авторское свидетельство СССР №1391653, М.кл. А 61 К 35/74, 1988 и штамм бактерий: Gluconobacter oxydans-02-продуцент бализа (всесоюзная коллекция микроорганизмов В-1974Д). Патент РФ №2026351, МПК (6) С 12 Р 1/04, С 12 N 1/20, А 61 К 35/74, 1995.

Однако эти штаммы обладают недостаточно высокой окислительной активностью и способны накапливать 2,6% бализа за 72 часа и за 48 часов соответственно.

Известен способ получения бализа патент РФ №20332412, МПК (6) С 12 Р 1/04, А 61 К 35/74, включающий выращивание посевного материала из штамма бактерий Gluconobacter oxydans в питательной среде, содержащей, г/л: маннита - 25, пептона - 3, дрожжевого автолизата жидкого с содержанием 350-500 мг% аминного азота - 50, остальное - вода, с последующим внесением его в ферментационную питательную среду и проведение глубинной ферментации, а затем ионообменную очистку.

Однако известный способ получения бализа трудоемок, используемые ионообменные смолы анионит АВ-17 в ОН^- форме и катионит КУ-2 в Н⁺ форме не позволяют получить бализ высокой степени очистки, и для подготовки анионита в ОН^- форме используется неэкологичное дорогостоящее сырье.

Технической задачей изобретения является выделение штамма, обладающего высокой окислительной активностью и разработка экологически чистого способа получения бализа с большей производительностью, экономичностью.

Указанная техническая задача решается использованием в качестве продуцента бализа вновь выделенного штамма бактерий Gluconobacter oxydans-03.

Для этого штамм бактерий Gluconobacter oxydans-03 выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: маннита - 25, пептона - 3, дрожжевого автолизата жидкого с содержанием 350-500 мг% аминного азота - 50, остальное - вода, в течение 30-36 часов и вносят в количестве 0,75% от объема ферментационной среды, содержащей 4% глюкозы, 1,5-2,0% дрожжевого автолизата жидкого с содержанием 350-500 мг% аминного азота, 0,01% фосфорнокислого калия однозамещенного, 0,005% аммония фосфорнокислого двузамещенного, вода остальное и проводят глубинную ферментацию в течение 30-36 часов.

Отделение культуральной жидкости от бактериальных клеток осуществляют с применением бентонита, которого берут не менее 0,6% от объема культуральной жидкости, с последующей ионообменной очисткой. Для ионообменной очистки использовали анионит АВ-17-8 чс в НСО₃ ^- форме и катионит Ку-2-8 чс в H⁺ форме.

Предлагаемый способ отличается от прототипа:

1. используемым штаммом бактерий;

2. количеством посевного материала, вносимого в ферментационную среду;

3. увеличением количества дрожжевого автолизата, вводимого в ферментационную среду;

4. отделением культуральной жидкости от бактериальных клеток бентонитом, взятым в количестве не менее 0,6% от объема культуральной жидкости;

5. для ионообменной очистки используют анионит АВ-17-8 чс в НСО₃ ^- форме и катионит Ку-2-8 чс в H⁺ форме.

Предлагаемый способ позволяет использовать более экологически чистое и дешевое сырье для подготовки ионообменных смол к работе и сократить сроки проведения ионообменной очистки, получив бализ высокой степени чистоты.

Предлагаемый штамм выделен на спелых плодах винограда, произрастающего в Анапском районе Краснодарского края, с применением традиционных микробиологических методов и хранится в коллекции музея чистых культур микроорганизмов OOO «Кубанской научно-производственной лаборатории физиологически активных веществ». Штамм хранят на питательной среде с маннитом с внесением 1,5% агара под вазелиновым маслом при температуре (+4) - (+6)°С. Он относится к семейству Pseudomonadaceae роду Gluconobacter виду oxydans и имеет следующие культурально-морфологические свойства: клетки суточной культуры на среде следующего состава, г: маннит - 25, пептон - 3, дрожжевой автолизат жидкий с содержанием 350-500 мг% аминного азота - 50, вода дистиллированная до 1 литра, имеют размеры (2,7-5,5)×(0,88-1,1) мкм.

Клетки двенадцатисуточной культуры на агаризованной среде выше указанного состава имеют размеры (2,2-5,5)×(0,44-0,88) мкм.

Форма клеток эллипсоидальная. Встречаются поодиночке, парами, реже цепочками. Движутся при помощи полярно расположенных жгутиков. Споры не образуют. Грамотрицательные.

Агаризованная среда с маннитом. Встречаются колонии двух форм и размеров:

1. колонии круглые, плоские по краю, выпуклые в центре, середина колоний непрозрачная, блестящие, поверхность гладкая, структура мелкозернистая, край слегка волнистый, консистенция маслянистая, равномерная суспензия в воде, цвет кремовый; диаметр колонии 8-11 мм;

2. колонии круглые, выпуклые, блестящие, поверхность гладкая, профиль изогнутый, структура мелкозернистая, край ровный, консистенция маслянистая, равномерная суспензия в воде, цвет кремовый; диаметр колоний 3.0-5.5 мм.

Сусло - агар. Встречаются колонии трех типов:

1. колонии круглые, блестящие, гладкие, профиль изогнутый, край слабоволнистый, структура мелкозернистая, равномерная суспензия в воде, цвет коричневый, консистенция маслянистая; диаметр колоний 1-3 мм;

2. колонии круглые, профиль изогнутый, край слегка волнистый, структура мелкозернистая, консистенция маслянистая, равномерная суспензия в воде, цвет кремовый, в центре коричневая точка; диаметр колоний 3,0-3,5 мм;

3. колонии неправильной формы, шероховатые, профиль плоский, край волнистый, консистенция маслянистая, равномерная суспензия в воде, цвет светло-коричневый; диаметр колоний 4,0-5,5 мм.

Картофельный агар. Колонии круглые, блестящие, профиль изогнутый, край ровный, структура мелокозернистая, консистенция маслянистая, равномерная суспензия в воде, цвет беловато-кремоватый; диаметр колоний от точечных до 2,5 мм.

Среда Захарова. Колонии круглые, блестящие, гладкие, край ровный, профиль плоский, структура мелкозернистая, консистенция маслянистая, равномерная суспензия в воде, цвет светло-коричневый по центру и кремовый по краю; диаметр колоний 1-2 мм.

Ферментационная среда. Колонии круглые, блестящие, профиль плоский, структура мелкозернистая, край ровный, консистенция маслянистая, равномерная суспензия в воде, цвет у одних колоний коричневый, у других - желтовато-коричневый; диаметр от точечных до 3 мм.

Рост на моркови умеренный, бежевого цвета, штрих блестящий, консистенция маслянистая.

Рост на картофеле слабый, штрих блестящий беловато-бежевого цвета. Консистенция маслянистая.

Рост на пиве и сахарозе умеренный, при этом среды из пива и сахарозы не загустевают. На среде с пивом пленки в течение 7 суток не образуется. По стенкам пробирки наблюдается кольцо из прикрепленных к стеклу клеток.

Физиолого-биохимические свойства штамма.

Оптимальное значение рН 5,0-5,5, оптимальная температура роста 28°С, строгий аэроб, каталозоположителен, сусло-желатину не разжижает, крахмал не гидролизует. Окисляет глюкозу до глюконовой кислоты, 2-кетоглюконовой кислоты, 5-кетоглюконовой кислоты и 2,5-дикетоглюконовой кислоты. Образует коричневый пигмент, способный к диффузии (культура штрихом на чашке Петри, питательная среда: глюкоза - 2,5%, КН ₂PO₄ - 0,01%, дрожжевой автолизат жидкий с содержанием 350-500 мг% аминного азота - 3%, СаСО₃ - 3%, агар-агар 1,5%).

Отношение к углеводам. Усваивает с образованием кислоты глюкозу и арабинозу. Не образует кислоту при использовании рамнозы, сахарозы, мальтозы, фруктозы, рафинозы.

Отношение к спиртам. Усваивает без образования кислоты инозит, маннит, глицерин, усваивает этанол с образованием кислоты, не усваивает дульцит и сорбит. Индол, сероводород не образует, нитраты не восстанавливает.

Влияние отличительных признаков, характеризующих заявляемый способ получения бализа, исследовали, помещая в стеклянный сосуд емкостью 120 литров 85 литров ферментационной питательной среды, содержащей от ее объема: 4% глюкозы, 0,01% калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,005% аммония фосфорнокислого двузамещенного и жидкий дрожжевой автолизат с содержанием 350-500 мг% аминного азота, остальное - вода. Далее в ферментационную питательную среду вносили посевной материал, содержащий штамм бактерий Gluconobacter oxydans-03, который выращивали в течение 30 часов на жидкой питательной среде состава, г/л: маннита - 25, пептона - 3, дрожжевого автолизата жидкого с содержанием 350-500 мг % аминного азота - 50, вода до 1 л. Ферментацию во всех опытах вели 72 часа. Через 24, 30, 36, 48 и 72 часа проверяли содержание бализа в культуральной жидкости после полного отделения ее от бактериальных клеток.

Результаты 13 из этих опытов приведены в таблице 1.

В первом опыте изучали влияние количества взятого бентонита на полноту отделения бактериальных клеток от культуральной жидкости. Выявили, что бентонита надо брать не менее 0,6% от объема культуральной жидкости. Во всех дальнейших опытах использование бентонита в таком количестве позволяет сократить сроки отделения культуральной жидкости от бактериальных клеток.

В опытах 2-5 исследовали влияние количества внесенного в ферментационную питательную среду дрожжевого автолизата жидкого на выход бализа. Установили, что необходимо брать 1,5-2,0% дрожжевого автолизата жидкого с содержанием 350-500 мг% аминного азота от объема ферментационной питательной среды.

Таблица 1 Влияние отличительных признаков на содержание бализа в культуральной жидкости, содержащей штамм бактерий Gluconobacter oxydans-03
№ опыта	Количество дрожжевого автолизата, %	Количество посевного материала, %	Количество бентонита, %	Полнота отделения клеток, %	Содержание бализа, % при времени отбора проб, ч
					24	30	36	48	72
1	0,5	0,5	0,4	80
			0,5	95
			0,6 0,7	100 100	1,5 1,5	2,1 2,1	2,2 2,2	2,6 2,6	3,1 3,1
2	1,0	0,5	0,6	100	1,5	2,1	2,2	2,6	3,1
3	1,5	0,5	0,6	100	1,5	2,1	2,2	2,6	3,1
4	2,0	0,5	0,6	100	1,5	2,1	2,2	2,6	3,1
5	2,5	0,5	0,6	100	1,5	2,1	2,2	2,6	3,1
6	1,0	0,75	0,6	100	1,7	2,4	2,6	2,6	3,1
7	1,0	1,0	0,6	100	1,7	2,4	2,6	2,6	3,1
8	1,5	0,75	0,6	100	2,1	3,1	3,1	3,1	3,1
9	1,5	1,0	0,6	100	2,1	3,1	3,15	3,1	3,1
10	2,0	0,75	0,6	100	2,1	3,1	3,15	3,1	3,1
11	2,0	1,0	0,6	100	2,1	3,1	3,15	3,1	3,1
12	2,5	0,75	0,6	100	2,1	3,1	3,15	3,1	3,1
13	2,5	1,0	0,6	100	2,1	3,1	3,15	3,1	3,1

Меняя количество посевного материала в опытах 6-13, установили, что его необходимо вносить в количестве не менее 0,75% от объема ферментационной питательной среды.

Для ионообменной очистки использовали смолы анионит АВ-17-8 чс в НСО₃ ^- форме и катионит Ку-2-8 чс в H ⁺ форме, которые позволили получить более очищенный от примесей бализ, сократить сроки химочистки и при подготовке смол к работе использовать менее дорогое и экологически чистое сырье.

Как видно из приведенных данных таблицы 1, предлагаемый способ получения бализа с введением в состав ферментационной питательной среды 1,5-2,0% от ее объема дрожжевого автолизата жидкого с содержанием 350-500 мг% аминного азота, использованием штамма бактерий Gluconobacter oxydans-03 и внесением в ферментационную питательную среду 0,75% от ее объема посевного материала, отделением бактериальных клеток от культуральной жидкости бентонитом, приводит к увеличению производительности способа получения бализа (выход бализа за 30-36 часов составляет 3,1%).

Рассмотрим пример конкретного выполнения, позволяющий сравнить способность накапливать бализ штаммами бактерий Gluconobacter oxydans-02 и Gluconobacter oxydans-03.

Посевные материалы, один с использованием штамма бактерий Gluconobacter oxydans-02, а другой со штаммом бактерий Gluconobacter oxydans-03, выращивали на жидких питательных средах состава, г/л: маннита - 25, пептона - 3, дрожжевого жидкого автолизата с содержанием 350-500 мг% аминного азота - 50, вода до 1 л, в течение 30 часов.

Брали два стеклянных сосуда вместимостью 120 литров, в которые помещали по 85 литров ферментационной питательной среды, содержащей от ее объема: 4% глюкозы, 0,01% калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,005% аммония фосфорнокислого двузамещенного и 2% дрожжевого автолизата жидкого с содержанием 350-500 мг% аминного азота, остальное - вода.

В первый сосуд с 85 литрами ферментационной питательной среды вносили 0,75% посевного материала, содержащего штамм бактерий Gluconobacter oxydans-02, во второй сосуд с 85 литрами ферментационной питательной среды вносили 0,75% посевного материала, содержащего штамм бактерий Gluconobacter oxydans-03. Ферментацию вели в обоих сосудах 72 часа. Через 24, 30, 36, 48 и 72 часа отбирали пробы культуральной жидкости в количестве 1 литра, отделяли ее от бактериальных клеток добавлением 0,6% бентонита и проверяли содержание бализа (табл.2).

Таблица 2 Содержание бализа в культуральной жидкости испытуемых штаммов бактерий Gluconobacter oxydans
Штамм бактерий	Содержание бализа, %, при времени отбора проб, ч
	24	30	36	48	72
Gluconobacter oxydans-02 (ВКМВ-1974Д)	1,39	1,5	2,0	2,6	3,1
Gluconobacter oxydans-03	2,1	3,1	3,15	3,1	3,1

Из приведенных данных в таблице 2 видно, что содержание бализа при использовании предлагаемого штамма бактерий Gluconobacter oxydans-03 после 30-36 часов ферментации такое же (3,1%), как в культуральной жидкости штамма - аналога на 72 часу ферментации.

Таким образом, предлагаемый штамм бактерий Gluconobacter oxydans-03 обладает повышенной окислительной активностью и его использование в качестве продуцента бализа способствует сокращению сроков ферментации в 2,4 раза.