способ диагностики токсоплазмоза у собак и кошек

Формула изобретения

Способ диагностики токсоплазмоза у собак и кошек, включающий исследование сыворотки крови этих животных, отличающийся тем, что исследуемую сыворотку крови, предварительно титрованную до разведения 1:16, вносят в лунки предметных стекол с корпускулярным антигеном токсоплазм, инкубируют во влажной камере 20 мин при +20°С, затем избыток сыворотки однократно отмывают физиологическим раствором 20 мин при +20°С и высушивают при этой же температуре, затем в каждую лунку добавляют люминесцирующие антитела против IgG собак или кошек соответственно, снова инкубируют во влажной камере при +20°С, предметные стекла еще раз отмывают и высушивают и затем просматривают в люминесцентном микроскопе, при обнаружении флюоресценции зеленого цвета по периферии клеток токсоплазм, четко контрастирующей с телом клетки, делают заключение о присутствии в исследуемой сыворотке специфических антител к токсоплазменному антигену, при положительном результате сыворотки в разведении 1:16 проводят ее дальнейшее титрование и разведение, при котором наблюдается слабое, но явное зеленое свечение периферии клетки не менее 50% токсоплазм в поле зрения, считают титром сыворотки, при выявлении высоких титров антител (1:256-1:512) или нарастании титров антител в 4 и более раз в двух образцах сыворотки, полученных от одного животного с интервалом 2-3 недели, ставят диагноз на токсоплазмоз.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лабораторной серологической диагностики токсоплазмоза у животных. Способ основан на непрямом методе выявления флуоресцирующих антител.

Решение проблемы диагностики паразитарных болезней животных с помощью серологических методов является перспективным направлением. Имеются данные об иммунологических методах, которые значительно ускоряют способ диагностики и повышают ее чувствительность [5, 6]. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) является одной из наиболее чувствительных и простых в серодиагностике токсоплазмоза у людей [1, 2].

Наиболее близким аналогом по технической сущности к изобретению является применяемая в настоящее время в ветеринарии для диагностики токсоплазмоза реакция связывания комплемента (РСК) [4]. В основе реакции лежит способность комплемента специфически связываться с комплексами антиген + антитело. Для выявления этой связи в виде лизиса эритроцитов требуется внесение в определенной последовательности дополнительных компонентов (инактивированной гемолитической сыворотки и эритроцитов барана). В реакции участвуют: структурный белок микробной клетки в качестве антигена, сыворотка крови животного с возможными антителами, комплемент, эритроциты барана, гемолитическая сыворотка. Недостатком этой реакции по сравнению с заявленной является многокомпонентность, высокая трудоемкость и долговременность (процесс связывания комплемента должен проводится в течение 16-18 часов), низкая чувствительность и специфичность [1, 2, 3].

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение чувствительности диагностики на всех стадиях заболевания токсоплазмозом, обеспечение надежности выявления инфекции на ранних стадиях при малом содержании антител в исследуемой сыворотке больного животного, сокращение времени и трудоемкости анализа.

Технический результат изобретения заключается в снижении числа компонентов реакции, упрощении выполнения исследования, в понижении ее трудоемкости и уменьшении затрат времени.

Сущность изобретения сводится к следующему. Предлагаемая РНИФ выполняется при наличии корпускулярного антигена токсоплазм, нанесенных промышленным путем в лунки предметных стекол, сыворотки животного и антител к иммуноглобулинам животного, меченных флюорохромом.

Отличия от прототипа: в реакции участвуют более специфичные компоненты (корпускулярный антиген токсоплазм, флюоресцирующая сыворотка), результат реакции учитывается с использованием люминесцентного микроскопа по наличию крупных светящихся комплексов.

Реакция может быть выполнена следующим образом: исследуемая сыворотка титруется до определенного разведения, вносится в лунки с антигеном. После экспозиции и отмывания избытка сыворотки в каждую лунку добавляются люминесцирующие антитела против IgG собак или кошек (конъюгат) в зависимости от вида исследуемых животных. Стекла еще раз отмывают, подсушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Обработанный люминесцирующими антителами комплекс антигена с антителами приобретает способность светиться. Интенсивность свечения прямо пропорциональна содержанию антител к антигенам токсоплазм в сыворотке. За результат реакции принимается последнее разведение исследуемой сыворотки, где интенсивность свечения выражается двумя крестами и более.

В качестве практического испытания предлагаемого способа диагностики токсоплазмоза были проведены обследования собак и кошек методами РНИФ и параллельно РСК в лаборатории протозойных инфекций ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Забор проб крови производился утром натощак. С целью отделения сыворотки кровь центрифугировали при 2000 об/в мин в течение 3-х минут. Исследовали два образца сыворотки одного и того же пациента, полученных с интервалом 3 недели. РНИФ выполнялась на тест системах "ТоксоФлюоСкрин" производства ООО "НИАРМЕДИКПЛЮС" с использованием люминесцентных конъюгатов против кошек и собак. Для РСК применялся "Набор для диагностики токсоплазмоза животных" производства ООО НПФ "Биоцентр" Омск-001 [4].

Перед проведением РНИФ готовятся рабочие разведения К+ (контрольная положительная сыворотка того вида животного, которое исследуется в реакции) и К- (контрольная отрицательная сыворотка того вида животного, которое исследуется в реакции). Для приготовления рабочих разведении контрольных и исследуемых сывороток используют 0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор).

На каждую лунку стекла с антигеном, нанесенного промышленным путем в лунки предметных стекол, наносят по 7-10 мкл анализируемых сывороток от собак или кошек. Стекла инкубируют во влажной камере 20 мин при +20°С. После этого стекла однократно отмывают 20 мин в физиологическом растворе и высушивают при +20°С.

Затем готовят рабочий раствор БСА (альбумин бычий сухой, меченный родамином).

Рабочий раствор ИФ (иммуноглобулины флюоресцирующие против глобулинов собак или кошек в зависимости от вида обследуемого животного) готовится на рабочем растворе БСА.

Полученный конъюгат (рабочее разведение ИФ на БСА) готовится непосредственно перед использованием. Конъюгат наносят на стекла (примерно по 10 мкл на лунку) и помещают во влажную камеру при 20°С. Затем мазки однократно промывают физиологическим раствором в течение 20 мин, а затем тщательно споласкивают дистиллированной водой. Стекла высушивают при 20°С и учитывают результат реакции в люминесцентном микроскопе (объектив 60х, окуляр 7х). Порядок расположения фильтров в микроскопе для водной иммерсии (от лампы): БС-8-3, СЗС-24-4, ФС-1-4 и запирающий ЖС-18+19 №1. При постановке реакции необходимо ставить следующие контроли:

1. Контроль с положительной сывороткой того вида животного, которое исследуется в реакции.

2. Контроль с отрицательной сывороткой того вида животного, которое исследуется в реакции.

3. Контроль на отсутствие неспецифического свечения ИФ и БСА (антиген + иммуноглобулины флюоресцирующие против глобулинов собак или кошек в зависимости от вида обследуемого животного с БСА в рабочем разведении).

Учет результатов начинают с оценки контролей. В положительном контроле при разведении 1:16 должна наблюдаться яркая флюоресценция зеленого цвета по периферии клеток токсоплазм, четко контрастирующая с телом клетки. По мере разведения сыворотки интенсивность свечения уменьшается. Титром сыворотки считается разведение, при котором наблюдается слабое, но явное зеленое свечение периферии клетки не менее 50% токсоплазм в поле зрения, причем оболочка клетки должна светиться полностью (свечение только полюсов клеток токсоплазм не учитывается). В контроле с отрицательной сывороткой и контроле №3 с ИФ и БСА свечение по периферии токсоплазм должно отсутствовать.

При отсутствии в исследуемых сыворотках специфических антител свечение по периферии токсоплазм не наблюдается. Наличие свечения свидетельствует о присутствии в исследуемой сыворотке специфических антител к токсоплазменному антигену. При положительном результате сыворотки в разведении 1:16 проводят ее дальнейшее титрование. Окончательный титр сыворотки определяется так же, как и в положительном контроле. Для диагностики заболевания (особенно острой формы) одного исследования недостаточно. Диагноз может быть установлен на основании исследования двух образцов сыворотки одного и того же животного, полученных с интервалом 2-3 недели. Выявление высоких титров антител (1:256-1:512) или нарастание титров антител в 4 и более раз следует рассматривать как заболевание.

Таким образом было обследовано 52 собаки и 47 кошек. В их число входили здоровые животные и с различными клиническими состояниями. Сопоставление результатов определения антител против токсоплазм в РНИФ и РСК приведено в таблице.

Из таблицы следует, что предложенным способом было выявлено 29 (29,3%) случаев инфицирования токсоплазмой из 99-и, по сравнению с 1-м (1,0%) сомнительным в РСК. При обследовании животных в динамике (через 3 недели) серопозитивные образцы получены у 29 особей (29,3%) и обнаружены только в РНИФ. Затраты по времени проведения РНИФ и РСК составили соответственно 2,5 ч и 16-18 ч.

Использование РНИФ как способа прижизненной иммунодиагностики токсоплазмоза у кошек и собак обеспечивает по сравнению с используемой в ветеринарии РСК следующие преимущества: повышение чувствительности в десятки раз, сокращение времени исследования в 6-7 раз.

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ТОКСОПЛАЗМ В РНИФ и РСК
Учитываемые показатели	РНИФ	РСК
1. 0бшее количество в группе:
гол.	99	99
2. Из них положительных:
гол.	29	1
%	29,3	1,0
при титре антител	от 1:16 до 1:256	1:256
3. При повторном обследовании через 3 недели:
гол.	29	отриц.
%	29,3	отриц.
при титре антител	от 1:16 до 1:256	отриц.
4. Затраты времени на проведение реакции:
час.	2,5	16-18

Источники информации

1. Воробьева М.Н., Равилов Р.Х., Герасимов В.В. Серологическая диагностика токсоплазмоза кошек // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Мат. Сибирской международной научно-практ. конф. Новосибирск, 2004. - С.67-68.

2. Грачева Л.И. Проблема токсоплазмоза // Вестник ветеринарии. - 1998. №7. - С.63-68.

3. Королева С.Н., Новак А.И. Эпизоотологический и эпидемиологический мониторинг при токсоплазмозе в центральном районе Российской федерации // Тр. Костромской гос.с/х академии. - Кострома, 2001. Вып.59. - С.24-29.

4. Наставление по применению набора для диагностики токсоплазмоза в РСК. Утверждено Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия 04.12.97 (13-7-2/1107).

5. Патент RU 2140085 C1, 1999 г.

6. Патент SU 1780006 A1, 1993 г.