средство для стимуляции репаративной регенерации печени и коррекции иммунной реактивности при экспериментальных токсических гепатопатиях

Формула изобретения

Применение опиоидного пептида DSLET, имеющего формулу Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr, для стимуляции репаративной регенерации гепатоцитов и коррекции иммунной реактивности при экспериментальных токсических гепатопатиях.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии и иммунологии, и может быть использовано для стимуляции регенерации гепатоцитов и коррекции иммунологических сдвигов в условиях токсических гепатопатий.

При токсических поражениях печени происходит гибель ее клеток. Так, даже однократное введение тетрахлорметана, помимо диффузной дистрофии гепатоцитов, вызывает массивные центролобулярные некрозы в паренхиме (примерно 40%) (J.Smejkalova J., Simek J., Rouchal I., Dvorackova. The time course of biochemical and histological changes following carbon tetrachloride-induced liver damage in rats of both sexes / // Physiol. Bohemoslov. - 1985. - Vol.34. - P.494-501). Поэтому применение средств, стимулирующих репаративную регенерацию гепатоцитов, позволяет ускорить восстановление печени.

Поскольку существенную роль в процессах регенерации и патогенезе заболеваний печени играет реактивность иммунной системы, возникает необходимость в ее коррекции при патологии (Логинов А.С. Иммунологические аспекты хронических заболеваний печени // Wises. Beitr. M. - Luther-Univ. Halle-Wittenberg R. - 1987. - N99. - P.192-198).

В условиях токсических гепатопатий может наблюдаться различная реакция иммунной системы. Поэтому для иммунокоррекции в одних случаях используются иммуностимуляторы, а в других - иммунодепрессанты. Иммуностимуляторы эффективны в борьбе с иммунодефицитами, наблюдающимися при некоторых формах патологии печени и для активации регенераторных процессов в органе. Иммуносупрессоры показаны для того, чтобы избежать повреждающего действия иммунных механизмов на печень (Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. - Киев: Наук. думка, 1991. - С.43), поскольку активация иммунного ответа может свидетельствовать о запуске аутоиммунных механизмов повреждения печени (Там же. С.77).

Поэтому в условиях гепатопатий предпочтение отдается препаратам выгодно сочетающих в себе как репаративные, так и иммунокорригирующие эффекты.

Синтетический опиоидный пептид DSLET (Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr) является высокоселективным лигандом опиоидных (дельта)-рецепторов (А.Н.Mulder, G.Wardeh, F.Hogenboom, A.L.Frankhuyzen. Selectivity of various opioid peptides towards delta-, kappa and mu-opioid receptors mediating presynaptic inhibition of neurotransmitter releasa in the brain / // Neuropeptides. - 1989. - Vol.14, №2. - P.99-104). Показано, что -опиоидные рецепторы экспрессируются лимфоцитами в различных лимфоидных органах (Sharp В.М., G.Gekker, M.D.Li. Delta-opioid suppression of human immunodeficiency virus-1 expression in T-cells (Jurkat) // Biochem. Pharmakol. - 1998. - Vol.56, №3. - P.289-292). На мембране гепатоцитов также обнаружены дельта-опиатные рецепторы (В.А.Виноградов, Н.Н.Самовилова, Л.В.Нагорная. Проблемы нейрогуморальной регуляции деятельности висцеральных систем - Л., 1987. - С.23-24), а их природные лиганды (энкефалины) влияют на метаболические процессы в клетках печени (Золоев Г.К. Влияние энкефалинов на некоторые механизмы эндокринной регуляции содержания гликогена в печени // Проблемы эндокринологии. - 1986. - Т.32, №2. - С.58-60).

Хорошо известны антиаритмические и кардиопротекторные эффекты опиоидного пептида DSLET (Осадчий О.Е. Протективное действие пептидов при аритмиях, индуцированных раздражением блуждающего нерва / О.Е.Осадчий // Тез. докл. I Съезда иммунологов России (23-25 июня 1992 г.; г.Новосибирск). - Новосибирск, 1992. - С.281; Чередник И.Л. Об особенностях реализации вагусного влияния на ритм сердца в условиях залпового раздражения блуждающего нерва при введении энкефалинов // Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций: Материалы конф. молодых физиологов и биохимиков России. - СПб, 1995. - С.195).

Также предложено использовать DSLET для стимуляции репаративного остеогенеза (Ляшев Ю.Д. Опиоидные пептиды как регуляторы репаративного остеогенеза / Автореф. дисс. на соискание уч. степени д.м.н., Курск - 2002, С.41) и при ожоговой травме (Николаев С.Б. Иммунометаболические эффекты опиоидных пептидов при термических ожогах / Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.м.н., Курск - 2004, С.10-13, С.20).

Получены данные о гастропротекторных эффектах агонистов -опиатных рецепторов (К. Gyres, A.Z.Ronai. Supraspinal delta- and mu-opioid receptors mediate gastric mucosal protection in the rat // J.Pharmacol. Exp. Ther. - 2000. - Vol.297, №3. - P.1010-1015) и их стимулирующие эффекты на процесс клеточного деления через опиатные рецепторы (Панькова Т.Д. Доказательства реализации стимулирующего эффекта даларгина на процесс клеточного деления через опиатные рецепторы / Т.Д.Панькова, С.С.Тимошин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1990. - Т.110, №7. - С.96-98).

Выявлено иммунорегуляторное действие опиоидных пептидов, в том числе и DSLET (Чейдо М.А. Участие дельта-опиоидных рецепторов в процессах иммуномодуляции / М.А.Чейдо, Т.В.Идова // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. - 1993. - Т.79, №12. - С.18-22).

Также опиоиды обладают анальгетической и противовоспалительной активностью (Зозуля А.А. Опиоиды и иммунитет / А.А.Зозуля, С.Ф.Пшеничкин // Итоги Науки и техники: Сер. "Иммунология". - 1990. - Т 25, С.48-120).

Таким образом, для опиоидов характерно сочетание иммуномодулирующих свойств, анальгетической и противовоспалительной активности (А.А.Зозуля, С.Ф.Пшеничкин. Опиоиды и иммунитет // Итоги науки и техники: Сер. "Иммунология". - 1990. - Т25, С.48-120). Все это дает основание предполагать возможность использования этих пептидов в качестве эффективных средств иммунокоррекции, а также с целью регуляции функций печени при ее патологии. Тем не менее, применение опиоидного пептида DSLET в условиях токсических гепатопатий не известно.

В качестве аналога того же назначения может быть приведен пример использования трипептида Gly-L-His-L-Lys для стимуляции физиологической и репаративной регенерации печени (Способ стимуляции физиологической и репаративной регенерации печени / М.Ю.Смахтин, И.А.Швейнов, А.А.Конопля, И.И.Бобынцев - Патент на изобретение N2214269, 20 октября 2003 г.).

Задачей изобретения является использование по новому назначению синтетического селективного лиганда (дельта)-опиатных рецепторов - пептида DSLET, имеющего формулу (Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr), а именно для стимуляции репаративной регенерации печени и коррекции иммунных сдвигов в условиях токсических гепатопатий.

Задача изобретения достигается путем применения опиоидного пептида DSLET при токсических гепатопатиях с целью стимуляции репаративной регенерации гепатоцитов и коррекции иммунной реактивности.

В настоящий момент, поскольку точно известна химическая формула этого пептида, он может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов либо куплен у фирм, занимающихся поставкой биологически активных соединений (Sigma, ICN, Merk, Bachim и др.). Нами был использован препарат, синтезированный в Кардиологическом научном центре РАМН.

Опиоидный пептид DSLET вводят парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 50 мкг/кг массы тела в 0,1 мл физиологического раствора десятикратно с интервалом в 24 часа между инъекциями экспериментальному животному (крысе) с токсической гепатопатией.

Пример конкретного выполнения.

Пример 1. Острую токсическую гепатопатию (ОТГ), сопровождающуюся повышением иммунной реактивности, вызывали у крыс путем пятикратного (один раз в сутки) внутримышечного введения 50% раствора тетрахлорметана (ТХМ) в растительном масле в дозе 3 мл/кг массы, чередуя лапы (Конопля А.И. Эндогенные имуномодуляторы как фактор сохранения гомеостаза при патологии печени: Дис....д-ра мед. наук - Киев, 1989. - 312 с.). Крысы Вистар были разделены на группы по 8-9 крыс в каждой. Группы животных представлены в таблице 1.

Соответствующая навеска DSLET растворялась в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводилась животным в объеме 0,1 мл десятикратно (один раз в сутки) внутрибрюшинно в дозах 1,5; 50 и 150 мкг/кг массы (до и одновременно с введением ТХМ). На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под эфирным наркозом, выделяли печень. Кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2 и заливали в парафин по общепринятой методике. Из этих органов изготовляли парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином, после чего изучали морфологическую картину органа, подсчитывая количество митозов и двуядерных гепатоцитов (Саркисов Д.С. Микроскопическая техника - М.: Медицина, 1996. - 543 с.). Вычисляли митотический индекс (МИ), отражающий активность клеточной формы регенерации, и индекс двуядерных гепатоцитов (ИДГ), показывающий выраженность ацитокинетической активности гепатоцитов как формы внутриклеточной регенерации и резерва полиплоидизации (Саркисов Д.С. 1987. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций: Руководство / Под ред. Д.С.Саркисова. - М.: Медицина, 1987. - 448 с.) Во всех дозах, начиная с дозы 1,5 мкг/кг, пептид повышал МИ и ИДГ (таблица 1).

Такие же группы животных были взяты для изучения состояния иммунологической реактивности. Об интенсивности гуморального иммунного ответа (ГИО) судили по количеству антителообразующих (АОК) клеток в селезенке на 5-й день после иммунизации экспериментальных животных (крысы) (Мальберг К., Зигль Э. Иммунологические методы / Под. ред. Г.Фримеля; Пер. с нем. А.П.Тарасова. - М., 1987 - с.273-282). В качестве антигена использовали эритроциты барана (ЭБ), которые вводили внутрибрюшинно одновременно с последней инъекцией гепатотропного яда. Пептид вводился до, во время и после иммунизации.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Введение ТХМ сопровождается развитием ОТГ и стимуляцией ГИО на Т-зависимый антиген-ЭБ.

Таблица 1
Гепато- и иммунотропные эффекты DSLET (M±m) в условиях ОТГ, вызванной ТХМ.
Условия опыта	МИ	ИДГ	АОК (103) на селезенку
1. Интактные животные	4,2±0,8	168,6±11,4	31,6±5,3
2. Введение масла и изотоничного раствора	5,8±1,1	179,9±11,9	32,7±5,4
3. Введение ТХМ и изотоничного раствора	10,3±2,1* 1, 2	233,7±15,2* 1, 2	86,3±10,4* 1, 2
4. Введение ТХМ и DSLET в дозе 1,5 мкг/кг	19,2±3,2* 1-3	316,2±17,2* 1-3	35,9±6,1* 3
5. Введение ТХМ и DSLET в дозе 50 мкг/кг	18,4±2,7* 1-3	263,8±16,1* 1, 2, 4	43,5±6,8* 3
6. Введение ТХМ и DSLET в дозе 150 мкг/кг	19,6±3,4* 1-3	265,1±16,9* 1, 2, 4	34,3±5,9* 3
Примечание: 1. МИ - митотический индекс гепатоцитов ( ). 2. ИДГ - индекс двуядерных гепатоцитов ( ). 3. АОК (103) на селезенку - количество антителообразующих клеток, тыс./селезенку. 4 - показывает достоверные отличия, Р<0,05. 5. Цифры рядом со звездочкой означают номера групп, с какими сравнивались различия.

В этих условиях введение пептида во всех использованных дозах стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов и нормализует иммунологическую реактивность, что можно расценивать как положительный эффект, препятствующий гиперактивации иммунной функции и возможному развитию аутоиммунных осложнений. (Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. - Киев: Наук. думка, 1991. - С.43, С.77).

Пример 2. В качестве модели острой токсической гепатопатии, сопровождающейся снижением иммунной реактивности, использовали поражение печени однократным внутрибрюшинным введением солянокислого гидразина (50 мг/кг) (Иванова А.П. Формирование иммунного ответа и его коррекция при токсическом поражении печени различной этиологии: Дис....канд. мед. наук - Курск, 1995. - 140 с.).

Соответствующая навеска DSLET растворялась в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводилась животным в объеме 0,1 мл десятикратно (один раз в сутки) внутрибрюшинно в тех же дозах 1,5; 50 и 150 мкг/кг массы (в течение 5 дней до поступления гидразина, одновременно и в течение 4 дней после него). На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под эфирным наркозом, выделяли печень. Кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2 и заливали в парафин по общепринятой методике. Из этих органов изготовляли парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином, после чего изучали морфологическую картину органа, подсчитывая количество митозов и двуядерных гепатоцитов и вычисляли МИ и ИДГ. Во всех дозах, начиная с дозы 1,5 мкг/кг, пептид повышал ИДГ более выражено в дозах 50 и 150 мкг/кг (таблица 2), влияя преимущественно на внутриклеточную форму регенерации в этих условиях.

Такие же группы животных были взяты для изучения состояния иммунологической реактивности. Об интенсивности гуморального иммунного ответа (ГИО) также судили по количеству антителообразующих (АОК) клеток в селезенке на 5-й день после иммунизации экспериментальных животных (крысы). Пептид вводился до, во время и после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ). Иммунизацию проводили одновременно с введением гидразина.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Введение гидразина сопровождается развитием ОТГ и снижением ГИО на Т-зависимый антиген-ЭБ. В этих условиях введение пептида во всех использованных дозах также стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов (повышает ИДГ)

Таблица 2
Гепато- и иммунотропные эффекты DSLET (M±m) в условиях ОТГ, вызванной гидразином.
Условия опыта	МИ	ИДГ	АОК (103) на селезенку
1. Интактные животные	4,6±0,7	154,6±10,2	28,7±5,1
2. Введение изотоничного раствора	5,4±1,1	162,3±11,1	30,2±5,8
3. Введение гидразина и изотонического раствора	10,5±2,1* 1, 2	226,8±12,4* 1, 2	15,4±2,6* 1, 2
4. Введение гидразина и DSLET в дозе 1,5 мкг/кг	9,1±1,8* 1, 2	298,0±14,6* 1-3	10,8±2,1* 1, 2
5. Введение гидразина и DSLET в дозе 50 мкг/кг	11,5±2,2* 1, 2	360,3±15,4* 1-4	23,9±2,4* 2-4
6. Введение гидразина и DSLET в дозе 150 мкг/кг	12,4±2,8* 1, 2	385,6±16,1* 1-4	22,3±2,2* 2-4
Примечание: 1. МИ - митотический индекс гепатоцитов ( ). 2. ИДГ - индекс двуядерных гепатоцитов ( ). 3. АОК (103) на селезенку - количество антителообразующих клеток, тыс./селезенку. 4. В каждой группе было по 8-9 животных. 5 - * - показывает достоверные отличия, Р<0,05. 6. Цифры рядом со звездочкой означают номера групп, с какими сравнивались различия.

и нормализует иммунологическую реактивность, устраняя тем самым иммунодефицитное состояние, в дозах 50 или 150 мкг/кг. В дозе 1,5 мкг/кг иммунокорригирующий эффект DSLET не наблюдался, поэтому наименьшей эффективной дозой в этих условиях можно считать - 50 мкг/кг. Поскольку эта доза пептида была одинаково эффективна как в условиях гепатопатии с повышенной (отравление ТХМ) или сниженной иммунной реактивностью (отравление гидразином) в дальнейшем можно рекомендовать именно дозу 50 мкг/кг как наиболее универсальную и экономичную (по сравнению с дозой 150 мкг/кг). Репаративный же эффект DSLET проявлялся во всех использованных дозах.

Таким образом, в условиях токсических гепатопатий, отличающихся по исходному уровню иммунной реактивности (как с ее повышением, так и снижением) опиоидный пептид DSLET стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов и корригирует состояние иммунной реактивности.