способ приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода azotobacter

Формула изобретения

Способ приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода Azotobacter путем культивирования их на питательной среде Берка, отличающийся тем, что культивирование бактерий ведут предварительно на плотной среде Эшби в течение 24-28 ч при температуре 26-28°С, затем их инокулируют в жидкую среду Берка с добавлением экстракта кормовых дрожжей в количестве 0,3-0,7 г/л, выдерживают в термостате при той же температуре в течение 20-24 ч при перемешивании, полученную накопительную культуру вносят в рабочий объем свежей среды Берка с добавлением триптофана 0,2-1,0 г/л и экстракта кормовых дрожжей, после культивирования в течение 40-48 ч при той же температуре готовый продукт помещают в холодильник для хранения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть реализовано в микробиологической промышленности для получения различных бактериальных удобрений.

Широко известно использование штаммов азотобактера при производстве удобрений, например штамм Azotobacter chroococcum T12, штамм Azotobacter chroococcum В-3173, депонированный в ЦМПМ ВНИИГенетики (см. пат. РФ №2074159, C 05 F 11/08, 1997). Недостатком указанных штаммов является отсутствие положительного эффекта в повышении урожайности зеленых культур, а также довольно высокое содержание нитратов в них, в случае использования для их возделывания бактериального удобрения на базе данного штамма.

Известно, что для стимулирования роста бактерий в питательную среду добавляют триптофан (см. Патент РФ №2035442, C 05 F 11/08, 1992). Используют его в сочетании со средой Муромцева для бактерий Achromobacter.

В качестве прототипа может быть рассмотрен способ синтеза штамма бактерий Azotobacter chroococcum ВКПМ В 6010, используемого для получения бактериального удобрения под зеленые культуры (см. патент РФ №2074159, C 08 F 11/08, 1997). Выращивают штамм в ферментере на питательной среде Берка до концентрации клеток 10⁸ -10⁹ клеток/мл.

Продукты синтеза на питательной среде Берка (после 4 суток инкубации при 28-30°С): биотин - 0,07, пиридоксин - 0,59, тиамин - 1,9 мг/л, гетероауксин - 65,0 мг/л. Азотфиксация - 0,26 мкг азота/мл в час.

Штамм Azotobacter chroococcum B35 обладает способностью прикрепляться к поверхности корней ряда зеленых культур, в частности сельдерея (Apium), петрушки (Petrocelinum) и салата (Lactuca sativa), где функционирует в течение 5 месяцев после инокуляции. В этом случае повышается урожайность зеленых культур и снижается содержание нитратов.

Однако известный способ не всегда позволяет получить быстрый прирост биомассы бактерий из-за особенностей физиологической активности определенного штамма. В состав известной среды для культивирования азотфиксаторов не входят соединения - предшественники синтеза фитогормонов (индолил-3-уксусной кислоты (ИУК)), а также ростовые факторы - стимуляторы прироста биомассы (витамины, аминокислоты). Для создания бактериального удобрения используется конкретный штамм, проявляющий свою активность при определенных условиях и используемый для выращивания определенных растений.

Решаемая задача - расширение возможностей использования широкого спектра штаммов бактерий рода Azotobacter для приготовления бактериальных удобрений.

Технический результат - повышение ростовой активности клеток бактерий и улучшение адаптации удобрений к конкретным условиям.

Этот технический результат достигается тем, что в способе приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода Azotobacter, включающем культивирование бактерий на питательной среде Берка, культивирование бактерий ведут предварительно на плотной среде Эшби в течение 24-28 часов, при температуре 26-28°C; затем ими инокулируют жидкую среду Берка с добавлением экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) в количестве 0,3-0,7 г/л (для получения биомассы клеток в экспоненциальной фазе), выдерживают в термостате при той же температуре в течение 20-24 часов при перемешивании; полученную накопительную культуру вносят в рабочий объем свежей среды Берка с добавлением триптофана 0,2-1,0 г/л и ЭКД, культивируют в течение 40-48 часов при той же температуре; затем помещают в холодильник для дальнейшего хранения.

Получают накопительную культуру штаммов азотобактера, обогащенную присутствием индолил-3-уксусной кислоты.

Предварительное культивирование бактерий на среде Эшби активирует азотфиксирующую способность.

Среда Берка имеет более богатый минеральный состав.

Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) содержит комплекс витаминов и аминокислот, что оказывает стимулирующее влияние на скорость размножения и азотфиксирующую активность. Использование ЭКД позволяет получить значительный прирост биомассы уже в первые 4-6 часов культивирования, независимо от количества внесенной культуры. Триптофан стимулирует синтез ИУК до количеств 40 мкг/мл культуральной жидкости, однако максимальное количество зависит от особенностей штамма.

ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

1. Культивируемый штамм высевают на плотную среду Эшби и культивируют в течение 24-28 часов, при температуре 26-28°С для накопления большой массы активно делящихся азотфиксирующих клеток.

2. Полученную массу клеток смывают с поверхности плотной среды 2-5 мл жидкой среды Берка и инокулируют в 0,5 литра среды Берка с добавлением 0,3-0,7 г/л ЭКД для получения популяции клеток с концентрацией 10⁹-10¹¹ кл/мл. Культивируют в течение 20-24 часов при той же температуре.

3. Полученную суспензию вносят в рабочий объем среды Берка (10-50 литров) с ЭКД и с добавлением триптофана (0,2-1,0 г/л). Триптофан вносят для интенсивного накопления ИУК в рабочем объеме среды. Культивируют в течение 40-48 часов, при температуре 26-28°С.

4. Готовый продукт хранят в холодильнике при температуре от 0 до 10°С.

ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА.

1. Культивируемый штамм высевают на плотную среду Эшби и культивируют в течение 26 часов, при температуре 27°С для накопления большой массы активно делящихся азотфиксирующих клеток.

Уменьшение времени культивирования не позволяет получить достаточную массу клеток, а увеличение - приводит к возрастанию сроков приготовления конечного продукта. Культивирование при температуре ниже 26°С продлевает сроки развития микробных клеток, повышение температуры может привести к преждевременному отмиранию части бактерий.

2. Полученную массу клеток смывают с поверхности плотной среды 2-5 мл жидкой среды Берка и инокулируют в 0,5 литра среды Берка с добавлением 0,5 г/л ЭКД для получения популяции клеток с концентрацией 10⁹-10¹¹ кл/мл. Культивируют в течение 22 часов. Сокращение сроков культивирования не позволяет получить достаточных концентраций клеток, а продление сроков приводит к общему увеличению времени для приготовления конечного продукта. Снижение количества вносимого экстракта кормовых дрожжей менее 0,3 г/л не позволяет получить достаточных концентраций бактерий в среде, а внесение избыточных количеств экстракта повышает стоимость конечного продукта, не давая существенных преимуществ препарату.

В таблице 1 приведены концентрации клеток разных штаммов бактерий Azotobacter в мл среды Берка. Все они давали значительный прирост биомассы.

3. Полученную суспензию вносят в рабочий объем среды Берка (10-50 литров) с ЭКД, с добавлением триптофана (0,6 г/л). Культивируют в течение 44 часов, при температуре 27°С. Увеличение дозы вносимого триптофана ведет к удорожанию процесса, уменьшение - не создает благоприятных условий для накопления фитостимулятора. Культивирование менее 40 часов не позволяет накопить достаточных концентраций фитогормона в конечном продукте, увеличение времени приводит к удорожанию процесса. Выбранный ранее температурный режим культивирования наиболее оптимален для развития клеток азотобактера.

В таблице 2 приведены концентрации ИУК, накапливаемой в среде Берка различными штаммами бактерий Azotobacter. Все они продуцировали достаточно высокие концентрации ИУК.

4. Через 44 часа полученный готовый продукт переносят в холодильник для хранения.

Для обоснования приведенных в формуле параметров проводили испытания на их крайних и запредельных значениях, на основании чего сделаны приведенные выше выводы.

Полученными препаратами обрабатывали семена различных культур и наблюдали активность их прорастания, а также прирост биомассы у выросшей 3-недельной рассады разных видов растений. Результаты исследований приведены в таблицах 3, 4 (таблица 3 - прорастание семян, таблица 4 - увеличение биомассы).

Таким образом, предлагается способ получения накопительной культуры для приготовления препарата из штаммов азотобактера, обитающих в почве конкретной территории и адаптированных к данным условиям среды.

Предложенный способ позволяет использовать в качестве основы для приготовления удобрения разные штаммы бактерий Azotobacter. При этом установлено, что они наиболее активны, если вносятся в ту же почву, откуда были выделены. О повышении урожайности можно судить по всхожести семян и эффективному накоплению биомассы растений (таблицы 3, 4).

Таблица 1
Исследуемые штаммы	Количество клеток в 1 мл среды Берка:
	без ЭКД			с ЭКД.
Az.chroococcum 66	2,5·106			20,4·108
Az.chroococcum 11	1,5·10 6			13,0·10 8
Az.chroococcum 12	1,4·106			13,5·109
Az.chroococcum 1	2,0·10 6			18,0·10 8
Az.chroococcum 6	15,0·106			60,0·107
Таблица 2
Исследуемые штаммы	Количество ИУК в среде Берка... (мкг/мл)
	без триптофана				с триптофаном
Az.chroococcum 6	0-следы				12,3
Az.chroococcum 11	0-следы				32,0
Az.chroococcum 12	0-следы				32,2
Az.chroococcum 1	0-следы				30,6
Az.chroococcum 66	0-следы				35,8
		Таблица 3
Исследуемые штаммы		Количество проросших семян из 100... (%)
		козлятника...				фасоли...
		необр.	обр-ых			необр.	обр-ых
Az.chroococcum 66		61	79			84	96
Az.chroococcum 11		69	76			87	95
Az.chroococcum 12		67	78			83	98
Az.chroococcum 1		71	79			89	98
Az.chroococcum б		51	72			91	97

Таблица 4
Исследуемые штаммы	Масса 100 3-недельных проростков... (г)
	козлятника...		фасоли...
	необр.	обр-ых	необр.	обр-ых
Az.chroococcum 66	4,2	11,4	275	315
Az.chroococcum 11	4,8	10,9	246	304
Az.chroococcum 12	4,3	10,5	239	308
Az.chroococcum 1	4,9	11,2	264	302
Az.chroococcum 6	4,4	10,8	283	311